利用CRISPR/Cas9系统构建MDV meq基因缺失株及其检测方法的建立

发布时间：2021-05-12 00:23

　　鸡马立克氏病（Marek’s disease,MD）是一种由鸡马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）引起的、鸡的淋巴组织增生性传染病,该病给养禽业造成巨大的经济损失。MD疫苗的使用很好地控制了该病,但其病原MDV呈现持续进化的趋势,给该病的防控带来困难。基因缺失疫苗由于删除了致病基因、同时最大程度保留了免疫原性,是最有发展前景的MD疫苗,这种疫苗具有良好的安全性和更高的免疫效力。由于MD疫苗不能建立免疫屏障,不能阻止野毒感染,为MDV的检测和监控带来困难。对MDV流行毒株的流行病学、病原学研究和新疫苗的开发是控制该病的主要措施。发展更好的病毒基因编辑技术和检测、监测方法是非常有必要的。本实验室分离的一株MDV野毒株BS/15株,基因分析表明其具有中国流行毒株的特有突变,同时其在体内复制能力强,具有更强的溶细胞感染能力和表现“晚毒力”特征。以其为亲本病毒构建基因缺失疫苗,具有成为高效MD疫苗的潜力。本研究利用CRISPR/Cas9技术,以BS/15株为研究模型,对其基因组中的主要致瘤基因meq基因进行了缺失。试验中,依据中国MDV分离株BS/15株的meq基... 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩略表
第一章 引言
    1.1 鸡马立克氏病(MD)
    1.2 鸡马立克氏病病毒(MDV)及其基因组结构
    1.3 MDV的主要功能基因
    1.4 MDV的毒力演化
    1.5 MDV的分子变异
    1.6 MDV功能基因研究
    1.7 本研究的目的意义
第二章 利用CRISPR/Cas9系统构建MDV meq基因缺失株的研究
    2.1 材料
        2.1.1 病毒和SPF鸡胚
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 实验仪器
    2.2 方法
        2.2.1 sgRNA的设计
        2.2.2 pX330质粒酶切和胶回收
        2.2.3 pMeq-sgRNA质粒构建
        2.2.4 PCR检测引物设计及分布
        2.2.5 pMeq-sgRNA初步筛选
        2.2.6 pMD-18T-GFP质粒构建
        2.2.7 pCAGGS-GFP质粒构建
        2.2.8 MDV△Meq重组毒拯救及体外生物学特性分析
        2.2.9 MDV荧光重组毒拯救
    2.3 结果
        2.3.1 pX330质粒酶切结果
        2.3.2 pMeq-sgRNA初步筛选
        2.3.3 pMD-18T-GFP质粒构建结果
        2.3.4 pCAGGS-GFP质粒构建结果
        2.3.5 MDV△Meq重组毒拯救结果
        2.3.6 MDV荧光重组毒拯救结果
    2.4 讨论
第三章 区分中国MDV野毒株与meq基因缺失株方法的建立
    3.1 材料
        3.1.1 病毒、SPF鸡胚和SPF鸡
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 实验仪器
    3.2 方法
        3.2.1 区分中国MDV野毒株与rBS△Meq株荧光定量PCR方法建立
        3.2.2 区分中国MDV野毒株与rMS△Meq株荧光定量PCR方法建立
    3.3 结果
        3.3.1 区分中国MDV野毒株与rBS△Meq株荧光定量PCR方法建立
        3.3.2 区分中国MDV野毒株与rMS△Meq株荧光定量PCR方法建立
    3.4 讨论
第四章 全文结论
参考文献
致谢
项目资助
作者简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]鸡马立克氏病病毒在鸡淋巴细胞和羽髓中的复制动力学分析[J]. 李晶梅,刘长军,张艳萍,施维松,曲鹏,刘爱玲,闫福海.  中国预防兽医学报. 2008(11)
[2]马立克氏病病毒Rispens株B抗原基因的克隆及其重组鸡痘病毒的构建[J]. 邢力,彭大新,朱爱华,刘秀梵,张如宽.  微生物学报. 1999(02)
[3]鸡马立克氏病毒Ⅰ型毒株的分离和鉴定[J]. 单松华,胡清林,孙智锋,袁勇,龚国华.  河南农业大学学报. 1997(02)



本文编号：3182378