PRRSV，PCV2和SS2多重PCR检测方法的建立及初步应用

发布时间：2021-05-15 08:11

　　猪繁殖与呼吸综合症病病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪链球菌2型（SS2）这三种病原体每年均能给养猪产业造成难以估量的经济损失。由于这三种病原体均能引起感染猪的呼吸道症状，且临床发病症状极为相似，难以通过临床诊断进行确诊。因此，对这三种病原体引起的疾病进行早期鉴别诊断，进而指导养殖户采取有效的控制措施显得尤为重要。本试验根据Gene Bank中发布的PRRSV的nsp2基因、PCV2的全基因和SS2的16s rRNA基因序列，分别找出其保守区并设计了三对特异性引物。建立并分别进行了优化检测PRRSV、PCV2和SS2三种病原体的单重PCR方法和多重PCR方法。三种病原体的单重PCR检测方法的反应条件中退火温度均确定为51.9℃，循环数的结果选定为35个循环；其中PCV2和SS2的单重PCR反应体系中（25μL体系）dNTP（2.5mM）加入量均确定为3μL，引物（10μmol/L）加入量均确定为0.7μL；PRRSV的单重PCR反应体系中（50μL体系）Mg2+（25mM）加入量确定为8μL，dNTP（10mM）加入量确定为5μL，引物（10μmol/L）加入量均确定为... 

【文章来源】：河北农业大学河北省

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略词表
目录
1 引言
    1.1 猪繁殖与呼吸综合征研究进展
        1.1.1 病原分子生物学特性
        1.1.2 流行病学及病理变化
        1.1.3 检测技术研究进展
    1.2 猪圆环病毒感染研究进展
        1.2.1 病原分子生物学特性
        1.2.2 流行病学及病理变化
        1.2.3 检测技术研究进展
    1.3 猪链球菌病研究进展
        1.3.1 病原分子生物学特性
        1.3.2 流行病学及病理变化
        1.3.3 检测技术研究进展
    1.4 研究的目的及意义
2 多重 PCR 方法的建立及初步应用
    2.1 材料
        2.1.1 参考毒株
        2.1.2 病料采集
        2.1.3 主要试剂及配制
        2.1.4 引物的设计与合成
        2.1.5 主要仪器
    2.2 方法
        2.2.1 细菌培养
        2.2.2 细胞复苏与培养
        2.2.3 病毒的增殖
        2.2.4 病原体RNA、DNA的提取
        2.2.5 单重PCR检测方法的建立
        2.2.6 PCR产物纯化与回收
        2.2.7 目的基因与pMD19-T载体连接
        2.2.8 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备-CaCl_2法
        2.2.9 连接产物的转化
        2.2.10 重组质粒的提取
        2.2.11 重组质粒的酶切鉴定
        2.2.12 序列测定
        2.2.13 单重PCR反应条件的优化
        2.2.14 多重PCR检测方法的建立
        2.2.15 多重PCR反应条件的优化
        2.2.16 多重PCR特异性试验
        2.2.17 单重PCR和多重PCR敏感性试验
        2.2.18 重复性试验
        2.2.19 单重PCR与多重PCR阳性符合率检测
        2.2.20 临床样品检测
3 结果
    3.1 单重 PCR 方法建立的结果
    3.2 重组质粒酶切鉴定结果
    3.3 序列测定及分析
    3.4 单重 PCR 反应条件的优化结果
        3.4.1 单重PCR方法退火温度优化结果
        3.4.2 单重PCR反应dNTP优化结果
        3.4.3 单重PCR反应引物优化结果
        3.4.4 单重 PCR 反应 Mg_2+优化结果
        3.4.5 单重PCR反应循环数优化结果
    3.5 多重 PCR 方法的建立结果
    3.6 多重 PCR 反应条件的优化结果
        3.6.1 多重PCR反应退火温度优化结果
        3.6.2 多重 PCR 反应 Mg2_+优化结果
        3.6.3 多重PCR反应dNTP优化结果
        3.6.4 多重PCR反应引物优化结果
        3.6.5 多重PCR反应循环数优化结果
    3.7 多重 PCR 反应特异性试验结果
    3.8 单重 PCR 和多重 PCR 反应敏感性试验结果
    3.9 重复性试验结果
    3.10 单重 PCR 与多重 PCR 阳性符合率检测结果
    3.11 临床样品检测结果
4 讨论
    4.1 单重 PCR 检测方法的建立
    4.2 多重 PCR 检测方法的建立
    4.3 应用多重 PCR 方法对临床样品的检测
5 结论
参考文献
附录
作者简历
致谢



本文编号：3187288