流感病毒M2与PB1-F2蛋白通过诱导自噬调节天然免疫的分子机制研究
发布时间：2021-05-17 00:45
A型流感病毒（Influenza A virus,IAV）是严重危害人类和动物健康的重要病原。IAV感染可通过多种调节机制迅速诱发宿主先天免疫反应,这对于病原体的清除和宿主的存活至关重要。然而,过度的炎症反应即“炎性风暴”将导致宿主免疫致病。IAV的M2（matrix protein 2）基质蛋白,是一个在流感病毒致病中很重要的质子选择性离子通道蛋白,它可刺激激活NLRP3（NLR family pyrin domain containing3）炎症小体的形成。自噬发生在胞质,是一个将寿命较长的蛋白、受损的细胞器及蛋白聚集体等进行包裹后与溶酶体融合发生降解的过程。其分为自噬小体形成及自噬小体与溶酶体融合两个阶段。流感病毒M2蛋白不但能够参与流感病毒感染后自噬小体形成的起始过程,还可抑制自噬小体与溶酶体的融合。但是M2蛋白是如何调节自噬的诱导过程及其与天然免疫之间的关系目前尚不清楚。另外,IAV也可通过多种复杂的免疫逃避机制以逃避宿主的免疫应答反应。其中,由IAV聚合酶蛋白PB1（Polymerase basic protein 1）编码的辅助蛋白PB1-F2可以使线粒体膜电势坍塌,且与...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：178 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语(Abbreviation)
第一章 流感病毒M2 蛋白通过与MAVS相互作用及增加ROS产量调节MAVS介导的信号通路相关机制的研究
1.前言
1.1 细胞自噬概述
1.1.1 自噬的定义
1.1.2 自噬的分类
1.1.3 自噬的过程及自噬体形成的分子机制
1.1.4 自噬信号通路的调控
1.1.5 自噬与病毒感染
1.1.6 自噬与RLRs及 I型 IFN信号途径
1.2 流感病毒
1.2.1 流感病毒概述
1.2.2 流感病毒与自噬
1.2.3 流感病毒与天然免疫反应
1.3 流感病毒基质蛋白M2
1.3.1 M2 蛋白的结构与功能
1.3.2 M2 蛋白的合成、装配、翻译后修饰及向细胞表面的转运
1.3.3 M2 蛋白调节vRNP的释放
1.3.4 M2 蛋白与病毒出芽及释放
1.3.5 M2 蛋白与宿主致病性
1.4 研究目的与意义
2 实验材料与试验方法
2.1 细胞与病毒
2.2 试剂和抗体
2.3 载体与质粒
2.4 siRNA合成
2.5 主要培养基和缓冲液的配制
2.6 主要实验仪器
2.7 实验方法
2.7.1 基因克隆
2.7.2 表达质粒构建
2.7.3 细胞的培养与传代
2.7.4 瞬时转染
2.7.5 双荧光素酶报告基因实验
2.7.6 细胞总RNA抽提
2.7.7 反转录PCR(RT-PCR)
2.7.8 细胞总基因组DNA抽提
2.7.9 Real-time RT-PCR
2.7.10 Western blot
2.7.11 免疫共沉淀实验(CoIP)
2.7.12 SDD-AGE(半变性琼脂糖胶蛋白电泳)
2.7.13 间接免疫荧光实验与SIM
2.7.14 线粒体-胞质分离实验
2.7.15 流式系统分析
2.7.16 统计学处理
3 结果与分析
3.1 M2 蛋白诱导自噬通过激活ATG5,抑制AKT-MTOR通路
3.1.1 H5N1/HM病毒M2 蛋白离子通道活性参与其诱导自噬小体的聚集过程
3.1.2 H5N1/HM病毒M2 蛋白能诱导自噬小体的起始且抑制自噬溶酶体形成
3.1.3 H5N1/HM M2 蛋白诱导自噬的起始依赖于ATG5及AKT-MTOR途径
3.2 M2 蛋白触发的Ca2+与ROS的产生参与了M2 诱导的自噬过程
3.2.1 M2 蛋白触发了Ca2+与ROS产量的升高
3.2.2 M2 蛋白诱导的Ca2+与ROS产量参与了其诱导的自噬过程
3.3 M2 蛋白能够定位于线粒体且影响线粒体动态
3.3.1 M2 蛋白能够靶向于线粒体
3.3.2 M2 蛋白促进了线粒体融合、增加了线粒体数量
3.4 M2 蛋白增强了天然免疫反应
3.4.1 M2 蛋白增强了SEV刺激激活的天然免疫反应
3.4.2 M2 蛋白增强了SEV刺激下IRF3与NFKB的磷酸化及Pro-IL1B表达
3.4.3 M2 蛋白参与了胞内抗病毒反应
3.4.4 M2 蛋白增强的天然免疫反应依赖于其离子通道活性
3.5 RLR通路中M2 蛋白靶分子的检测
3.5.1 M2 蛋白增强了MAVS介导的抗病毒天然免疫反应
3.5.2 M2与MAVS相互作用并共定位
3.5.3 M2 蛋白与ATG5及LC3B竞争性的与MAVS结合
3.5.4 M2 蛋白增加了MAVS聚集体的形成
3.6 M2 蛋白与MAVS互作区域的探究
3.6.1 M2 蛋白上His37 是其与MAVS相互作用的关键位点
3.6.2 MAVS蛋白的完整性是其与M2 蛋白相互作用所必需的
3.7 M2 蛋白增加MAVS的聚集依赖于其触发的ROS产生
3.7.1 Ca2+与ROS参与了M2 蛋白增强的抗病毒天然免疫反应
3.7.2 M2 蛋白增加MAVS聚集体的形成依赖于其触发的ROS产生
3.8 M2 蛋白诱导的自噬过程负向调节其增强的天然免疫反应
4 讨论与总结
4.1 讨论
4.1.1 M2 蛋白诱导了ATG5及AKT-MTOR依赖的自噬过程
4.1.2 M2 蛋白增强的MAVS介导的天然免疫反应与线粒体动态关系
4.1.3 M2 蛋白触发的ROS的产生与流感病毒致病性关系
4.1.4 M2 蛋白拮抗自噬增强天然免疫反应
4.2 总结
第二章 流感病毒PB1-F2蛋白通过诱导线粒体自噬抑制宿主抗病毒天然免疫的分子机制研究
1.前言
1.1 线粒体自噬
1.1.1 线粒体自噬及其分子机制
1.1.2 线粒体自噬与病毒感染
1.2 流感病毒蛋白PB1-F2
1.2.1 PB1-F2 的结构
1.2.2 PB1-F2 的致病机理
1.3 研究目的与意义
2 实验材料与试验方法
2.1 病毒
2.2 抗体
2.3 表达质粒及突变体质粒构建
2.4 siRNA合成
3 结果与分析
3.1 PB1-F2 蛋白过表达诱导线粒体自噬
3.1.1 PB1-F2 蛋白过表达诱导完全自噬
3.1.2 PB1-F2 蛋白过表达诱导线粒体自噬
3.2 PB1-F2 蛋白介导了TUFM依赖的线粒体自噬
3.2.1 PB1-F2 蛋白与TUFM蛋白相互作用并共定位
3.2.2 PB1-F2 蛋白的C端与TUFM蛋白的domain I区域是两者相互作用的关键区域.
3.3 PB1-F2 蛋白抑制了线粒体自噬依赖的I型 IFN的产生
3.3.1 PB1-F2 蛋白抑制I型 IFN产生依赖于TUFM
3.3.2 PB1-F2 蛋白抑制了线粒体自噬依赖的天然免疫反应
3.4 PB1-F2 蛋白作为线粒体自噬受体与LC3B相互作用
3.4.1 PB1-F2 蛋白与LC3B相互作用
3.4.2 PB1-F2 蛋白与LC3B相互作用的关键区域
3.4.3 PB1-F2 蛋白的LIR区域是其诱导线粒体自噬的关键区域
3.4.4 PB1-F2 蛋白的LIR区域是其抑制天然免疫的关键区域
4 讨论与总结
4.1 讨论
4.1.1 PB1-F2 蛋白诱导TUFM依赖的完全线粒体自噬
4.1.2 PB1-F2 蛋白削弱线粒体自噬依赖的I型 IFN的产生
4.2 总结
参考文献
附表1:本文中基因克隆所用的 PCR 引物序列
附表2:本文所用荧光定量 RCR 引物序列
附图:表达质粒载体图谱
个人资料
致谢
本文编号：3190732
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：178 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语(Abbreviation)
第一章 流感病毒M2 蛋白通过与MAVS相互作用及增加ROS产量调节MAVS介导的信号通路相关机制的研究
1.前言
1.1 细胞自噬概述
1.1.1 自噬的定义
1.1.2 自噬的分类
1.1.3 自噬的过程及自噬体形成的分子机制
1.1.4 自噬信号通路的调控
1.1.5 自噬与病毒感染
1.1.6 自噬与RLRs及 I型 IFN信号途径
1.2 流感病毒
1.2.1 流感病毒概述
1.2.2 流感病毒与自噬
1.2.3 流感病毒与天然免疫反应
1.3 流感病毒基质蛋白M2
1.3.1 M2 蛋白的结构与功能
1.3.2 M2 蛋白的合成、装配、翻译后修饰及向细胞表面的转运
1.3.3 M2 蛋白调节vRNP的释放
1.3.4 M2 蛋白与病毒出芽及释放
1.3.5 M2 蛋白与宿主致病性
1.4 研究目的与意义
2 实验材料与试验方法
2.1 细胞与病毒
2.2 试剂和抗体
2.3 载体与质粒
2.4 siRNA合成
2.5 主要培养基和缓冲液的配制
2.6 主要实验仪器
2.7 实验方法
2.7.1 基因克隆
2.7.2 表达质粒构建
2.7.3 细胞的培养与传代
2.7.4 瞬时转染
2.7.5 双荧光素酶报告基因实验
2.7.6 细胞总RNA抽提
2.7.7 反转录PCR(RT-PCR)
2.7.8 细胞总基因组DNA抽提
2.7.9 Real-time RT-PCR
2.7.10 Western blot
2.7.11 免疫共沉淀实验(CoIP)
2.7.12 SDD-AGE(半变性琼脂糖胶蛋白电泳)
2.7.13 间接免疫荧光实验与SIM
2.7.14 线粒体-胞质分离实验
2.7.15 流式系统分析
2.7.16 统计学处理
3 结果与分析
3.1 M2 蛋白诱导自噬通过激活ATG5,抑制AKT-MTOR通路
3.1.1 H5N1/HM病毒M2 蛋白离子通道活性参与其诱导自噬小体的聚集过程
3.1.2 H5N1/HM病毒M2 蛋白能诱导自噬小体的起始且抑制自噬溶酶体形成
3.1.3 H5N1/HM M2 蛋白诱导自噬的起始依赖于ATG5及AKT-MTOR途径
3.2 M2 蛋白触发的Ca2+与ROS的产生参与了M2 诱导的自噬过程
3.2.1 M2 蛋白触发了Ca2+与ROS产量的升高
3.2.2 M2 蛋白诱导的Ca2+与ROS产量参与了其诱导的自噬过程
3.3 M2 蛋白能够定位于线粒体且影响线粒体动态
3.3.1 M2 蛋白能够靶向于线粒体
3.3.2 M2 蛋白促进了线粒体融合、增加了线粒体数量
3.4 M2 蛋白增强了天然免疫反应
3.4.1 M2 蛋白增强了SEV刺激激活的天然免疫反应
3.4.2 M2 蛋白增强了SEV刺激下IRF3与NFKB的磷酸化及Pro-IL1B表达
3.4.3 M2 蛋白参与了胞内抗病毒反应
3.4.4 M2 蛋白增强的天然免疫反应依赖于其离子通道活性
3.5 RLR通路中M2 蛋白靶分子的检测
3.5.1 M2 蛋白增强了MAVS介导的抗病毒天然免疫反应
3.5.2 M2与MAVS相互作用并共定位
3.5.3 M2 蛋白与ATG5及LC3B竞争性的与MAVS结合
3.5.4 M2 蛋白增加了MAVS聚集体的形成
3.6 M2 蛋白与MAVS互作区域的探究
3.6.1 M2 蛋白上His37 是其与MAVS相互作用的关键位点
3.6.2 MAVS蛋白的完整性是其与M2 蛋白相互作用所必需的
3.7 M2 蛋白增加MAVS的聚集依赖于其触发的ROS产生
3.7.1 Ca2+与ROS参与了M2 蛋白增强的抗病毒天然免疫反应
3.7.2 M2 蛋白增加MAVS聚集体的形成依赖于其触发的ROS产生
3.8 M2 蛋白诱导的自噬过程负向调节其增强的天然免疫反应
4 讨论与总结
4.1 讨论
4.1.1 M2 蛋白诱导了ATG5及AKT-MTOR依赖的自噬过程
4.1.2 M2 蛋白增强的MAVS介导的天然免疫反应与线粒体动态关系
4.1.3 M2 蛋白触发的ROS的产生与流感病毒致病性关系
4.1.4 M2 蛋白拮抗自噬增强天然免疫反应
4.2 总结
第二章 流感病毒PB1-F2蛋白通过诱导线粒体自噬抑制宿主抗病毒天然免疫的分子机制研究
1.前言
1.1 线粒体自噬
1.1.1 线粒体自噬及其分子机制
1.1.2 线粒体自噬与病毒感染
1.2 流感病毒蛋白PB1-F2
1.2.1 PB1-F2 的结构
1.2.2 PB1-F2 的致病机理
1.3 研究目的与意义
2 实验材料与试验方法
2.1 病毒
2.2 抗体
2.3 表达质粒及突变体质粒构建
2.4 siRNA合成
3 结果与分析
3.1 PB1-F2 蛋白过表达诱导线粒体自噬
3.1.1 PB1-F2 蛋白过表达诱导完全自噬
3.1.2 PB1-F2 蛋白过表达诱导线粒体自噬
3.2 PB1-F2 蛋白介导了TUFM依赖的线粒体自噬
3.2.1 PB1-F2 蛋白与TUFM蛋白相互作用并共定位
3.2.2 PB1-F2 蛋白的C端与TUFM蛋白的domain I区域是两者相互作用的关键区域.
3.3 PB1-F2 蛋白抑制了线粒体自噬依赖的I型 IFN的产生
3.3.1 PB1-F2 蛋白抑制I型 IFN产生依赖于TUFM
3.3.2 PB1-F2 蛋白抑制了线粒体自噬依赖的天然免疫反应
3.4 PB1-F2 蛋白作为线粒体自噬受体与LC3B相互作用
3.4.1 PB1-F2 蛋白与LC3B相互作用
3.4.2 PB1-F2 蛋白与LC3B相互作用的关键区域
3.4.3 PB1-F2 蛋白的LIR区域是其诱导线粒体自噬的关键区域
3.4.4 PB1-F2 蛋白的LIR区域是其抑制天然免疫的关键区域
4 讨论与总结
4.1 讨论
4.1.1 PB1-F2 蛋白诱导TUFM依赖的完全线粒体自噬
4.1.2 PB1-F2 蛋白削弱线粒体自噬依赖的I型 IFN的产生
4.2 总结
参考文献
附表1:本文中基因克隆所用的 PCR 引物序列
附表2:本文所用荧光定量 RCR 引物序列
附图:表达质粒载体图谱
个人资料
致谢
本文编号：3190732
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3190732.html
