猪瘟病毒石门株与C株感染宿主细胞差异表达基因及其在病毒致病中的作用
发布时间：2021-05-18 17:02
猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起的猪的一种高度接触性传染病。在过去的几十年中，我国通过采取兔化弱毒疫苗免疫接种与扑杀相结合等措施，有效地控制了猪瘟的流行，但近年来我国猪瘟疫情又有所抬头，尤其是慢性猪瘟和非典型猪瘟成为该病的主要发生形式，给猪瘟防控工作造成了新的困难。虽然近年来对CSFV致病机理的研究取得一定进展，但之前的研究工作中，主要是对全病毒或病毒的某个或某些基因对宿主细胞的一些致病作用及其机理进行研究，而缺乏对CSFV感染后宿主细胞转录水平调控应答的系统分析，不清楚哪些应答才是CSFV强毒株引起宿主细胞发生的致病性及病理性改变的关键所在。为此，本论文开展猪瘟病毒石门株与猪瘟病毒C株感染猪静脉血管内皮细胞（SUVEC）及巨噬细胞后宿主细胞基因表达的差异性研究，并通过对猪瘟病毒感染后宿主细胞mRNA转录组水平的基因调控应答特征分析，为阐明猪瘟病毒的致病机理提供有价值的科学依据。研究工作取得了以下结果：（1）建立了区分猪瘟病毒石门株与猪瘟病毒C株的高分辨率熔解曲线（HRM）检测方法。与以往PCR技术比较，该方法具有单管操作、无须设计特异性探针等优势，既可以实现对猪瘟病毒石门株...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：129 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
文献综述
第一章 病毒与宿主细胞的相互作用及猪瘟病毒研究进展
1.1 病毒与宿主细胞的相互作用
1.1.1 病毒感染细胞的基本生命特征
1.1.2 病毒感染细胞后相互作用的差异性
1.1.3 细胞对病毒感染的应答
1.2 猪瘟病毒研究进展
1.2.1 猪瘟病毒感染的分子生物学基础
1.2.2 猪瘟病毒感染的复杂机制
1.3 应用高通量测序技术开展猪瘟病毒致病机制研究的可行性
试验研究
第二章 高分辨率溶解曲线技术区分猪瘟病毒石门株和 C 株检测方法的建立
2.1 材料
2.1.1 病毒株、细胞系及临床样品
2.1.2 主要试剂及耗材
2.1.3 主要仪器设备
2.2 方法
2.2.1 细胞培养及病毒的感染
2.2.2 临床样品的准备
2.2.3 RNA 提取与纯化
2.2.4 cDNA 的合成
2.2.5 引物的设计与合成
2.2.6 CSFV 的 PCR 检测
2.2.7 通过 HRM 分析法检测和鉴别 CSFV Shimen 株和 C 株
2.2.8 质量控制
2.3 结果
2.3.1 SUVEC 中 CSFV 的 PCR 检测
2.3.2 SUVEC 中 CSFV Shimen 株和 CSFV C 株的 qPCR 检测
2.3.3 SUVEC 中 CSFV Shimen 株和 CSFV C 株的 HRM 标准化检测
2.3.4 SUVEC 中 CSFV Shimen 株和 CSFV C 株的 HRM 鉴别性检测
2.3.5 临床样品中 CSFV 的 PCR 检测
2.3.6 应用 HRM 分析方法检测临床样品的 CSFV 感染
2.3.7 应用 HRM 分析方法鉴别感染临床样本的 CSFV 不同毒力株
2.3.8 质量控制
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 高通量测序技术解读猪瘟病毒石门株感染 SUVEC 后的基因早期表达
3.1 材料
3.1.1 病毒株、细胞系
3.1.2 主要试剂及耗材
3.1.3 主要仪器设备
3.1.4 配制的溶液
3.2 方法
3.2.1 细胞培养、病毒感染及 RNA 提取
3.2.2 cDNA 的合成
3.2.3 CSFV 检测引物的设计与合成
3.2.4 CSFV 的 PCR 检测
3.2.5 SUVEC 的 DGE 标签文库的构建和 Solexa 测序
3.2.6 DGE 标签文库的标签筛选
3.2.7 基因表达注释
3.2.8 筛选差异表达基因
3.2.9 Gene Ontology 功能显著性与 Pathway 显著性富集分析
3.2.10 DGE 检测的 qPCR 验证
3.3 结果
3.3.1 DGE 测序标签文库的分析结果
3.3.2 基因注释与结果分析
3.3.3 DGE 测序文库的生物重复性检测
3.3.4 DEG 分析差异表达基因的确定
3.3.5 差异表达基因的鉴别注释
3.3.6 差异表达基因的 GO 功能富集性分析
3.3.7 差异表达基因的信号通路富集性分析
3.3.8 qPCR 方法对 DGE 检测分析结果的验证
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 猪瘟病毒石门株和 C 株感染 SUVEC 差异表达基因分析
4.1 材料
4.1.1 病毒株与细胞系
4.1.2 主要试剂及耗材
4.1.3 主要仪器设备
4.2 方法
4.2.1 细胞培养、病毒感染及 RNA 提取
4.2.2 CSFV 检测引物的设计与合成
4.2.3 cDNA 的合成
4.2.4 CSFV 的 PCR 检测
4.2.5 qPCR 法建立 CSFV 增殖曲线
4.2.6 DGE 标签文库的构建和 Solexa 测序
4.2.7 DGE 标签文库的标签筛选及基因表达注释
4.2.8 差异表达基因的筛选
4.2.9 Gene Ontology 功能显著性与 Pathway 显著性富集分析
4.2.10 DGE 检测分析结果的验证
4.2.11 DGE 的聚类分析和网络互作分析
4.3 结果
4.3.1 SUVEC 的 RNA 质量检测
4.3.2 CSFV 的 RT-PCR 检测和 qPCR 检测结果
4.3.3 DGE 测序标签文库的分析结果
4.3.4 DGE 测序标签文库的测序饱和度分析
4.3.5 差异表达基因的确定
4.3.6 差异表达基因的 GO 功能富集分析
4.3.6.1 CSFV Shimen 感染组和未感染病毒组差异基因的 GO 功能富集性分析
4.3.6.2 CSFV C 感染组和未感染病毒组差异基因的 GO 功能富集性分析
4.3.6.3 CSFV Shimen 感染组和 CSFV C 感染组差异基因的 GO 功能富集性分析
4.3.7 差异表达基因的 Pathway 富集分析
4.3.8 CSFV Shimen 株与 CSFV C 株不同感染对血液循环系统关键基因表达的影响
4.3.9 血液循环系统差异表达关键基因的 GO 功能归类分析
4.3.10 DGE 检测分析结果的 qPCR 验证
4.4 讨论
4.4.1 CSFV Shimen 株感染对 SUVEC 应答机制的分析
4.4.2 感染与血液循环系统相关基因表达的关系
4.5 小结
第五章 猪瘟病毒石门株对 SUVEC 中 VEGF-C 表达的影响
5.1 材料
5.1.1 病毒株与细胞系
5.1.2 主要试剂
5.1.3 主要仪器设备
5.2 方法
5.2.1 CSFV Shimen 株感染 SUVEC
5.2.2 CSFV Shimen 株感染 SUVEC 的 RT-PCR 检测
5.2.3 CSFV Shimen 株感染 SUVEC 的 qPCR 检测
5.2.4 CSFV Shimen 株感染 SUVEC 的间接免疫荧光法检测
5.2.5 VEGF 表达的生物信息学分析
5.2.6 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF 表达的 ELISA 检测
5.2.7 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF-C 表达的 PCR 检测
5.2.8 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF-C 表达的 qPCR 检测
5.2.9 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF-C 表达的 Western blot 检测
5.2.10 数据统计分析
5.3 结果
5.3.1 VEGF 表达的生物信息学分析
5.3.2 CSFV Shimen 株感染 SUVEC 的 RT-PCR 检测
5.3.3 CSFV Shimen 株感染 SUVEC 的 Realtime-PCR 检测
5.3.4 CSFV Shimen 株感染 SUVEC 的间接免疫荧光法检测
5.3.5 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF 表达的 ELISA 检测
5.3.6 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF-C 表达的 PCR 检测
5.3.7 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF-C 表达的 qPCR 检测
5.3.8 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF-C 表达的 Western blot 检测
5.4 讨论
5.5 小结
第六章 猪瘟病毒石门株和 C 株感染巨噬细胞差异表达基因分析及石门株对 P53 信号通路调控的初步研究
6.1 材料
6.1.1 病毒株与细胞系
6.1.2 主要试剂及耗材
6.1.3 主要仪器设备
6.2 方法
6.2.1 细胞培养、病毒感染及 RNA 提取
6.2.2 CSFV 检测引物的设计与合成
6.2.3 cDNA 的合成
6.2.4 CSFV 感染巨噬细胞后的 PCR 检测和 qPCR 检测
6.2.5 DGE 标签文库的构建、Solexa 测序、标签筛选及注释表达基因
6.2.6 差异表达基因的筛选及 qPCR 验证
6.2.7 Gene Ontology 功能显著性与 Pathway 显著性富集分析
6.2.8 流式细胞仪检测细胞周期
6.2.9 细胞因子 mRNA 的 qPCR 检测和表达蛋白的 Western blot 检测
6.3 结果
6.3.1 巨噬细胞的 RNA 质量检测
6.3.2 巨噬细胞中 CSFV 的 RT-PCR 检测和 qPCR 检测结果
6.3.3 DGE 测序标签文库的分析结果
6.3.4 DGE 测序标签文库的测序饱和度分析
6.3.5 差异表达基因的确定
6.3.6 差异表达基因的 GO 功能富集分析
6.3.7 差异表达基因的 Pathway 富集显著性分析
6.3.8 DGE 检测分析结果的 qPCR 验证
6.3.9 CSFV Shimen 株致巨噬细胞 p53 信号通路调控细胞周期改变的初步研究
6.4 讨论
6.5 小结
结论
本研究的创新点
参考文献
主要缩略词和中英文对照表（Abbreviation Index）
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]非典型猪瘟的发病特点及控制措施[J]. 陈芹. 福建畜牧兽医. 2012(03)
[2]自身免疫性肝炎新型抗原分子高迁移率族蛋白B1的克隆表达鉴定及蛋白纯化[J]. 赵擎,辛绍杰,胡燕,侯俊,貌盼勇. 实用预防医学. 2007(01)
本文编号：3194165
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：129 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
文献综述
第一章 病毒与宿主细胞的相互作用及猪瘟病毒研究进展
1.1 病毒与宿主细胞的相互作用
1.1.1 病毒感染细胞的基本生命特征
1.1.2 病毒感染细胞后相互作用的差异性
1.1.3 细胞对病毒感染的应答
1.2 猪瘟病毒研究进展
1.2.1 猪瘟病毒感染的分子生物学基础
1.2.2 猪瘟病毒感染的复杂机制
1.3 应用高通量测序技术开展猪瘟病毒致病机制研究的可行性
试验研究
第二章 高分辨率溶解曲线技术区分猪瘟病毒石门株和 C 株检测方法的建立
2.1 材料
2.1.1 病毒株、细胞系及临床样品
2.1.2 主要试剂及耗材
2.1.3 主要仪器设备
2.2 方法
2.2.1 细胞培养及病毒的感染
2.2.2 临床样品的准备
2.2.3 RNA 提取与纯化
2.2.4 cDNA 的合成
2.2.5 引物的设计与合成
2.2.6 CSFV 的 PCR 检测
2.2.7 通过 HRM 分析法检测和鉴别 CSFV Shimen 株和 C 株
2.2.8 质量控制
2.3 结果
2.3.1 SUVEC 中 CSFV 的 PCR 检测
2.3.2 SUVEC 中 CSFV Shimen 株和 CSFV C 株的 qPCR 检测
2.3.3 SUVEC 中 CSFV Shimen 株和 CSFV C 株的 HRM 标准化检测
2.3.4 SUVEC 中 CSFV Shimen 株和 CSFV C 株的 HRM 鉴别性检测
2.3.5 临床样品中 CSFV 的 PCR 检测
2.3.6 应用 HRM 分析方法检测临床样品的 CSFV 感染
2.3.7 应用 HRM 分析方法鉴别感染临床样本的 CSFV 不同毒力株
2.3.8 质量控制
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 高通量测序技术解读猪瘟病毒石门株感染 SUVEC 后的基因早期表达
3.1 材料
3.1.1 病毒株、细胞系
3.1.2 主要试剂及耗材
3.1.3 主要仪器设备
3.1.4 配制的溶液
3.2 方法
3.2.1 细胞培养、病毒感染及 RNA 提取
3.2.2 cDNA 的合成
3.2.3 CSFV 检测引物的设计与合成
3.2.4 CSFV 的 PCR 检测
3.2.5 SUVEC 的 DGE 标签文库的构建和 Solexa 测序
3.2.6 DGE 标签文库的标签筛选
3.2.7 基因表达注释
3.2.8 筛选差异表达基因
3.2.9 Gene Ontology 功能显著性与 Pathway 显著性富集分析
3.2.10 DGE 检测的 qPCR 验证
3.3 结果
3.3.1 DGE 测序标签文库的分析结果
3.3.2 基因注释与结果分析
3.3.3 DGE 测序文库的生物重复性检测
3.3.4 DEG 分析差异表达基因的确定
3.3.5 差异表达基因的鉴别注释
3.3.6 差异表达基因的 GO 功能富集性分析
3.3.7 差异表达基因的信号通路富集性分析
3.3.8 qPCR 方法对 DGE 检测分析结果的验证
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 猪瘟病毒石门株和 C 株感染 SUVEC 差异表达基因分析
4.1 材料
4.1.1 病毒株与细胞系
4.1.2 主要试剂及耗材
4.1.3 主要仪器设备
4.2 方法
4.2.1 细胞培养、病毒感染及 RNA 提取
4.2.2 CSFV 检测引物的设计与合成
4.2.3 cDNA 的合成
4.2.4 CSFV 的 PCR 检测
4.2.5 qPCR 法建立 CSFV 增殖曲线
4.2.6 DGE 标签文库的构建和 Solexa 测序
4.2.7 DGE 标签文库的标签筛选及基因表达注释
4.2.8 差异表达基因的筛选
4.2.9 Gene Ontology 功能显著性与 Pathway 显著性富集分析
4.2.10 DGE 检测分析结果的验证
4.2.11 DGE 的聚类分析和网络互作分析
4.3 结果
4.3.1 SUVEC 的 RNA 质量检测
4.3.2 CSFV 的 RT-PCR 检测和 qPCR 检测结果
4.3.3 DGE 测序标签文库的分析结果
4.3.4 DGE 测序标签文库的测序饱和度分析
4.3.5 差异表达基因的确定
4.3.6 差异表达基因的 GO 功能富集分析
4.3.6.1 CSFV Shimen 感染组和未感染病毒组差异基因的 GO 功能富集性分析
4.3.6.2 CSFV C 感染组和未感染病毒组差异基因的 GO 功能富集性分析
4.3.6.3 CSFV Shimen 感染组和 CSFV C 感染组差异基因的 GO 功能富集性分析
4.3.7 差异表达基因的 Pathway 富集分析
4.3.8 CSFV Shimen 株与 CSFV C 株不同感染对血液循环系统关键基因表达的影响
4.3.9 血液循环系统差异表达关键基因的 GO 功能归类分析
4.3.10 DGE 检测分析结果的 qPCR 验证
4.4 讨论
4.4.1 CSFV Shimen 株感染对 SUVEC 应答机制的分析
4.4.2 感染与血液循环系统相关基因表达的关系
4.5 小结
第五章 猪瘟病毒石门株对 SUVEC 中 VEGF-C 表达的影响
5.1 材料
5.1.1 病毒株与细胞系
5.1.2 主要试剂
5.1.3 主要仪器设备
5.2 方法
5.2.1 CSFV Shimen 株感染 SUVEC
5.2.2 CSFV Shimen 株感染 SUVEC 的 RT-PCR 检测
5.2.3 CSFV Shimen 株感染 SUVEC 的 qPCR 检测
5.2.4 CSFV Shimen 株感染 SUVEC 的间接免疫荧光法检测
5.2.5 VEGF 表达的生物信息学分析
5.2.6 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF 表达的 ELISA 检测
5.2.7 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF-C 表达的 PCR 检测
5.2.8 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF-C 表达的 qPCR 检测
5.2.9 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF-C 表达的 Western blot 检测
5.2.10 数据统计分析
5.3 结果
5.3.1 VEGF 表达的生物信息学分析
5.3.2 CSFV Shimen 株感染 SUVEC 的 RT-PCR 检测
5.3.3 CSFV Shimen 株感染 SUVEC 的 Realtime-PCR 检测
5.3.4 CSFV Shimen 株感染 SUVEC 的间接免疫荧光法检测
5.3.5 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF 表达的 ELISA 检测
5.3.6 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF-C 表达的 PCR 检测
5.3.7 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF-C 表达的 qPCR 检测
5.3.8 CSFV Shimen 株感染后 SUVEC 中 VEGF-C 表达的 Western blot 检测
5.4 讨论
5.5 小结
第六章 猪瘟病毒石门株和 C 株感染巨噬细胞差异表达基因分析及石门株对 P53 信号通路调控的初步研究
6.1 材料
6.1.1 病毒株与细胞系
6.1.2 主要试剂及耗材
6.1.3 主要仪器设备
6.2 方法
6.2.1 细胞培养、病毒感染及 RNA 提取
6.2.2 CSFV 检测引物的设计与合成
6.2.3 cDNA 的合成
6.2.4 CSFV 感染巨噬细胞后的 PCR 检测和 qPCR 检测
6.2.5 DGE 标签文库的构建、Solexa 测序、标签筛选及注释表达基因
6.2.6 差异表达基因的筛选及 qPCR 验证
6.2.7 Gene Ontology 功能显著性与 Pathway 显著性富集分析
6.2.8 流式细胞仪检测细胞周期
6.2.9 细胞因子 mRNA 的 qPCR 检测和表达蛋白的 Western blot 检测
6.3 结果
6.3.1 巨噬细胞的 RNA 质量检测
6.3.2 巨噬细胞中 CSFV 的 RT-PCR 检测和 qPCR 检测结果
6.3.3 DGE 测序标签文库的分析结果
6.3.4 DGE 测序标签文库的测序饱和度分析
6.3.5 差异表达基因的确定
6.3.6 差异表达基因的 GO 功能富集分析
6.3.7 差异表达基因的 Pathway 富集显著性分析
6.3.8 DGE 检测分析结果的 qPCR 验证
6.3.9 CSFV Shimen 株致巨噬细胞 p53 信号通路调控细胞周期改变的初步研究
6.4 讨论
6.5 小结
结论
本研究的创新点
参考文献
主要缩略词和中英文对照表（Abbreviation Index）
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]非典型猪瘟的发病特点及控制措施[J]. 陈芹. 福建畜牧兽医. 2012(03)
[2]自身免疫性肝炎新型抗原分子高迁移率族蛋白B1的克隆表达鉴定及蛋白纯化[J]. 赵擎,辛绍杰,胡燕,侯俊,貌盼勇. 实用预防医学. 2007(01)
本文编号：3194165
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