副猪嗜血杆菌—猪霍乱沙门氏菌二联基因工程疫苗研究
发布时间：2021-05-19 02:32
副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis, HPS）是常规饲养猪群上呼吸道中寄生的一种常在菌,但在动物体应激、免疫力低下等情况下某些分离株可侵入机体并引发严重的全身性疾病,临床特征主要表现为纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等。近年来鉴于养殖场饲养模式的不断调整以及新型呼吸道疾病的层出不穷,副猪嗜血杆菌病日趋流行,对世界养猪业造成了巨大危害。近年来基因工程产业发展迅猛,使得疫苗的研发无论在方法上还是在观念上都发生了重大转变。当前应用基因重组技术构建沙门氏菌减毒菌株和利用减毒沙门氏菌作为活载体表达外源抗原研制多联疫苗等已成为研究热点之一。本课题是基于猪霍乱沙门氏菌C500菌株Aasd缺失株平衡致死载体系统进行副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程疫苗研发。基本思路是利用仔猪副伤寒商品疫苗菌株猪霍乱沙门氏菌C500作为宿主菌株,插入已经蛋白质组学方法筛选鉴定的副猪嗜血杆菌重要免疫原性基因hps06257、HbpB及PalA,从而获得副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程疫苗菌株C501（06257）、C501（HbpB）、 C501（PalA）,并对这些重组菌株进行生物...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
目录
摘要
ABSTRACT
縮略语表
1 文献综述
1.1 副猪嗜血杆菌研究进展
1.1.1 病原学与发病机理
1.1.2 流行病学
1.1.3 临床症状和病理变化
1.1.4 诊断
1.1.5 防制
1.2 减毒沙门氏菌活疫苗载体系统研究进展
1.2.1 减毒策略
1.2.2 免疫机理
1.2.3 减毒沙门氏菌活疫苗载体系统的优势与局限
1.2.4 减毒沙门氏菌活疫苗载体系统的临床应用
1.2.5 沙门氏菌载体活疫苗与肠道粘膜免疫
2 前言
3 材料与方法
3.1 细菌、质粒及试验动物
3.2 主要试剂、培养基及缓冲液
3.2.1 试验试剂
3.2.2 常用培养基的配制
3.2.3 常用溶液的配制
3.2.4 主要试验器材
3.3 试验方法
3.3.1 副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程疫苗菌株构建
3.3.2 二联基因工程疫苗菌株生物学特性鉴定
3.3.3 疫苗菌株C501(06257)、C501(HbpB)、C500(PalA)安全性评价
3.3.4 副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程疫苗制备
3.3.5 二联重组基因工程疫苗小鼠免疫试验
3.3.6 免疫小鼠体内疫苗菌株的定植检测
3.3.7 二联重组基因工程疫苗对免疫小鼠的攻毒保护性试验
4 结果与分析
4.1 二联基因工程疫苗重组菌株构建
4.1.1 目的基因分析与克隆
4.1.2 表达质粒pYA-06257、pYA-HbpB和pYA-PalA酶切鉴定
4.1.3 重组菌株C501(06257)、C501(HbpB)及C500(PalA)鉴定
4.2 重组菌株生物学特性鉴定研究
4.2.1 重组菌株C501(06257)、C501(HbpB)及C500(PalA)表达特性
4.2.2 重组疫苗菌株遗传稳定性研究
4.2.3 重组菌C501(06257)、C501(HbpB)及C500(PalA)生长特性研究
4.2.4 重组菌株生化特性鉴定
4.2.5 重组菌株对小鼠的LD_(50)测定
4.3 重组菌株对易感仔猪的安全性评估
4.4 重组蛋白HPS06257、HbpB及PalA的SDS-PAGE分析
4.5 免疫小鼠特异性抗体检测
4.5.1 HPS06257特异性抗体水平检测及其亚类分析
4.5.2 HbpB特异性抗体水平检测及其亚类分析
4.5.3 PalA特异性抗体水平检测及其亚类分析
4.5.4 沙门氏菌抗原特异性IgG水平检测
4.5.5 免疫小鼠体内IgA水平检测
4.6 免疫小鼠组织载菌分布检测
4.7 免疫小鼠攻毒试验
4.7.1 免疫小鼠对副猪嗜血杆菌SH0165菌株的攻毒保护试验
4.7.2 免疫小鼠对猪霍乱沙门氏菌C78-1菌株的攻毒保护试验
5 讨论
5.1 猪霍乱沙门氏菌及其作为疫苗载体的应用前景
5.2 关于副猪嗜血杆菌病防控的一些探讨
5.3 副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌疫苗研究的结果与反思
6 小结
6.1 主要结论
6.2 值得进一步探讨的问题
附录
参考文献
致谢
本文编号：3194942
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
目录
摘要
ABSTRACT
縮略语表
1 文献综述
1.1 副猪嗜血杆菌研究进展
1.1.1 病原学与发病机理
1.1.2 流行病学
1.1.3 临床症状和病理变化
1.1.4 诊断
1.1.5 防制
1.2 减毒沙门氏菌活疫苗载体系统研究进展
1.2.1 减毒策略
1.2.2 免疫机理
1.2.3 减毒沙门氏菌活疫苗载体系统的优势与局限
1.2.4 减毒沙门氏菌活疫苗载体系统的临床应用
1.2.5 沙门氏菌载体活疫苗与肠道粘膜免疫
2 前言
3 材料与方法
3.1 细菌、质粒及试验动物
3.2 主要试剂、培养基及缓冲液
3.2.1 试验试剂
3.2.2 常用培养基的配制
3.2.3 常用溶液的配制
3.2.4 主要试验器材
3.3 试验方法
3.3.1 副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程疫苗菌株构建
3.3.2 二联基因工程疫苗菌株生物学特性鉴定
3.3.3 疫苗菌株C501(06257)、C501(HbpB)、C500(PalA)安全性评价
3.3.4 副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程疫苗制备
3.3.5 二联重组基因工程疫苗小鼠免疫试验
3.3.6 免疫小鼠体内疫苗菌株的定植检测
3.3.7 二联重组基因工程疫苗对免疫小鼠的攻毒保护性试验
4 结果与分析
4.1 二联基因工程疫苗重组菌株构建
4.1.1 目的基因分析与克隆
4.1.2 表达质粒pYA-06257、pYA-HbpB和pYA-PalA酶切鉴定
4.1.3 重组菌株C501(06257)、C501(HbpB)及C500(PalA)鉴定
4.2 重组菌株生物学特性鉴定研究
4.2.1 重组菌株C501(06257)、C501(HbpB)及C500(PalA)表达特性
4.2.2 重组疫苗菌株遗传稳定性研究
4.2.3 重组菌C501(06257)、C501(HbpB)及C500(PalA)生长特性研究
4.2.4 重组菌株生化特性鉴定
4.2.5 重组菌株对小鼠的LD_(50)测定
4.3 重组菌株对易感仔猪的安全性评估
4.4 重组蛋白HPS06257、HbpB及PalA的SDS-PAGE分析
4.5 免疫小鼠特异性抗体检测
4.5.1 HPS06257特异性抗体水平检测及其亚类分析
4.5.2 HbpB特异性抗体水平检测及其亚类分析
4.5.3 PalA特异性抗体水平检测及其亚类分析
4.5.4 沙门氏菌抗原特异性IgG水平检测
4.5.5 免疫小鼠体内IgA水平检测
4.6 免疫小鼠组织载菌分布检测
4.7 免疫小鼠攻毒试验
4.7.1 免疫小鼠对副猪嗜血杆菌SH0165菌株的攻毒保护试验
4.7.2 免疫小鼠对猪霍乱沙门氏菌C78-1菌株的攻毒保护试验
5 讨论
5.1 猪霍乱沙门氏菌及其作为疫苗载体的应用前景
5.2 关于副猪嗜血杆菌病防控的一些探讨
5.3 副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌疫苗研究的结果与反思
6 小结
6.1 主要结论
6.2 值得进一步探讨的问题
附录
参考文献
致谢
本文编号：3194942
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