猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达纯化及其多克隆抗体的制备

发布时间：2021-05-19 02:50

　　猪圆环病毒3型（porcine circovirus 3,PCV-3）是近些年发现的一种新型猪圆环病毒,在临床上能引起猪的多种疾病,给世界养猪业造成严重危害和巨大损失。现今,世界各国对PCV-3的研究尚处于起步阶段,检测方法还局限在分子生物学水平,尚无大规模诊断和预防PCV-3的方法,导致了商品化ELISA检测试剂盒和疫苗的缺口,因此各国研究学者正加紧针对PCV-3的进一步研究。目前报道表明,PCV-3 ORF2序列编码的重要结构蛋白Cap具有良好的免疫原性,能够诱导免疫反应,用其作为抗原研制ELISA检测试剂盒,有利于区分在临床症状上相似的PCV-3、PCV-2、PNDS等疾病,方便对规模化猪场进行PCV-3的大量检测和流行病学调查。为高效表达PCV-3 Cap蛋白,本研究以PCV-3 ORF2序列为模板,先对其序列上的稀有密码子进行简单优化（上海生工）,针对优化后序列设计引物,扩增出625bp大小的目的片段,与带有His标签的pET-28a载体质粒分别进行酶切后连接成为重组质粒,转化到大肠杆菌表达菌株中,挑取阳性菌落,经酶切鉴定和测序验证后诱导表达,经SDS-Page和Wester... 

【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

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英文缩略词表
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 猪圆环病毒概述
        1.1.1 猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)
        1.1.2 猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease, PCVD)
    1.2 研究背景
        1.2.1 历史背景
        1.2.2 研究现状
    1.3 猪圆环病毒3型的病原学
        1.3.1 形态特征及理化学特性
        1.3.2 基因组结构与功能
        1.3.3 培养特性
    1.4 猪圆环病毒3型的流行病学
    1.5 猪圆环病毒3型的病理特征
        1.5.1 临床症状
        1.5.2 病理变化
    1.6 猪圆环病毒3型的诊断方法
        1.6.1 病毒的分离与鉴定
        1.6.2 分子生物学检测方法
    1.7 猪圆环病毒3型的防治措施
    1.8 本研究的目的与意义
第二章 PCV-3 Cap蛋白的原核表达及纯化
    2.1 材料
        2.1.1 猪圆环病毒3型的阳性病料
        2.1.2 所用载体和菌株
        2.1.3 主要的药品、试剂及其生产厂家
        2.1.4 试剂配方
        2.1.5 实验仪器
    2.2 方法
        2.2.1 序列突变和引物的设计
        2.2.2 目的基因的扩增
        2.2.4 PCR产物的鉴定、回收和双酶切
        2.2.5 原核表达载体的获取和双酶切
        2.2.6 目的片段和载体质粒的连接
        2.2.7 转化
        2.2.8 重组蛋白的表达和鉴定
        2.2.9 重组蛋白的纯化
    2.3 结果
        2.3.1 序列突变和引物的设计
        2.3.2 PCR扩增结果
        2.3.3 重组质粒酶切鉴定和PCR鉴定
        2.3.4 重组表达质粒菌液PCR鉴定结果
        2.3.5 PCV-3 ORF2生工测序结果
        2.3.6 重组蛋白表达后鉴定
        2.3.7 包涵体蛋白的判断和处理
        2.3.8 重组蛋白的纯化
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 多克隆抗体的制备
    3.1 材料
        3.1.1 实验动物和实验所需抗原
        3.1.2 主要药品、试剂及其生产厂家
        3.1.3 试剂配方
        3.1.4 主要仪器
    3.2 方法
        3.2.1 蛋白的复性
        3.2.2 胶体金免疫印记实验
        3.2.3 病毒粒子观察-负染电镜观察(TEM)
        3.2.4 抗原的制备
        3.2.5 动物免疫
        3.2.6 血清收集
        3.2.7 抗体鉴定
    3.3 结果
        3.3.1 胶体金免疫印记实验
        3.3.2 负染电镜观察
        3.3.3 Western Blot鉴定
        3.3.4 ELISA检测
    3.4 讨论
    3.5 小结
结论
参考文献
附录
致谢



本文编号：3194967