miR-181a-5p和内质网应激对成肌分化的调控作用研究

发布时间：2017-04-21 07:05

  本文关键词：miR-181a-5p和内质网应激对成肌分化的调控作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：成肌分化过程涉及多种生物学通路,大量的研究表明miRNAs和内质网应激在成肌分化过程中发挥重要的调控作用。研究显示miR-181a-5p能够靶向结合Hox-A11,上调成肌分化关键基因MyoD, MyoG的表达量,促进成肌分化。此外,内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress,ERS)能够通过ERS介导的凋亡途径促进分化过程中分化能力较弱的细胞凋亡,提高分化效率。因而我们推测：niR-181a-5p和ERS在成肌分化过程中可能存在协同效应,共同促进成肌分化,但需要进一步的实验验证。本研究分析了C2C12细胞分化过程中miR-181a-5p的表达趋势,通过转染miRNA mimics和inhibitor,实现过表达和干扰miRNA,探究了miR-181a-5p对C2C12细胞增殖、分化、内质网应激和肌纤维类型的影响。用毒胡萝卜素(Thapsigargin, Tg)处理C2C12细胞,使细胞发生ERS,探究了ERS对C2C12细胞内源性miR-181a-5p和成肌分化的影响。最后对Tg预处理的C2C 12细胞和猪肌肉成纤维细胞(Porcine Muscle Fibroblasts, PMFs)过表达和干扰miR-181a-5p,分析了ERS情况下,miR-181a-5p对C2C12细胞和PMFs凋亡的影响,并利用双荧光素酶报告系统验证了猪上GRP78和ssc-miR-181a-5p的靶标关系。主要结果如下(1) miR-181a-5p的种子序列及其在GRP78上的结合序列在不同物种中序列高度保守,荧光定量PCR (RT-qPCR)结果显示miR-181a-5p在C2C12细胞分化过程中的表达量呈上升趋势。(2) RT-qPCR检测发现过表达miR-181a-5p促进C2C12细胞分化,靶基因GRP78的mRNA表达量有所降低,但未达到显著水平(P0.05),成肌分化相关基因Myod, MyoG, Myf5, Myf6和ERS介导的凋亡通路相关基因ATF6, Casp12, CHOP, EIF-2α的mRNA表达量显著升高(P0.01或P0.05)；干扰miR-181a-5p抑制C2C12细胞分化,靶基因GRP78的mRNA表达水平显著升高(P0.01),成肌分化相关基因Myod, MyoG, Myf5, Myf6和ERS介导的凋亡通路相关基因ATF6, Casp12, CHOP EIF-α的mRNA表达量显著降低(P0.01或P0.05)。凋亡抑制基因BCL2的mRNA表达量在过表达和干扰miR-181a-5p时均显著降低(P0.01或P0.05)。(3)过表达miR-181a-5p显著增加了MyHc Ⅱa的mRNA表达量(P0.01),显著降低了MyHc Ⅰ的mRNA表达量(P0.05),使肌纤维中Ⅱ型肌纤维的含量升高；抑制miR-181a-5p显著降低了MyHcⅡα的mRNA表达量(P0.01),从而增加了Ⅰ型肌纤维的含量。(4)过表达或抑制miR-181a-5p后,利用CCK-8细胞增殖和毒性检测试剂分析miR-181a-5p对C2C12细胞增殖的影响,与对照组相比,过表达和抑制miR-181a-5p对C2C12细胞增殖影响均不显著(P0.05)。(5)用0.1μM Tg处理C2C12细胞,24 h时RT-qPCR检测发现,Tg处理显著增加了ERS介导的凋亡通路相关基因ATF6,Casp12,CHOP,EIF-2α和GRP78的mRNA表达量(P0.01),成功诱导细胞发生ERS。同时,Tg处理后,C2C12细胞中miR-181a-5p和成肌分化相关基因Myf5,Myf6和MyoD的mRNA表达量显著升高(P0.01)。(6)用0.1 μM Tg处理C2C12细胞,向细胞中过表达 miR-181a-5p,24 h时Hoechst染色发现细胞核碎片增加,CCK-8分析发现细胞活性显著降低(P0.01),RT-qPCR检测发现ERS介导的凋亡通路相关基因ATF6,Casp12,CHOP,EIF-2α的mRNA表达量显著升高(P0.01),靶基因GRP78和抗凋亡基因BCL2的表达量显著降低(P0.01)；抑制miR-181a-5p,细胞核碎片,细胞活性以及基因表达量实验结果与过表达miR-181a-5p相反。(7)成功构建猪GRP78基因的双荧光素酶报告质粒,利用双荧光素酶报告系统检测发现猪GRP78和ssc-miR-181a-5p存在靶标关系,且靶基因的mRNA水平不受调控(P0.05),初步揭示ssc-miR-181a-5p可能在蛋白水平抑制靶基因的表达。(8)体外分离培养PMFs,0.1μM Tg处理PMFs细胞,向细胞中过表达ssc-miR-181a-5p,24 h时候发现细胞核碎片增加,细胞活性显著降低(P0.01),靶基因GRP78的mRNA表达量显著降低(P0.01),ERS介导的凋亡通路相关基因ATF6,EIF-2α的mRNA表达量显著升高(P0.01)；抑制ssc-181a-5p细胞核碎片,细胞活性以及基因表达量与过表达ssc-miR-181a-5p实验结果相反。
【关键词】：miR-181a-5p 内质网应激 成肌分化 细胞凋亡
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.2
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 符号说明10-13
• 1 文献综述13-22
• 1.1 骨骼肌形成概述13-14
• 1.1.1 骨骼肌的生长发育过程13
• 1.1.2 骨骼肌纤维分类13-14
• 1.1.3 参与骨骼肌生长发育的转录因子14
• 1.2 miRNA简述14-18
• 1.2.1 miRNA的形成及调控机制15
• 1.2.2 miRNA的鉴定及检测方法15-16
• l 2.3 miRNA的靶基因预测及验证方法16-17
• 1.2.4 miR-181a-5p研究现状17-18
• 1.3 内质网应激18-19
• 1.3.1 内质网应激主要的生物学通路18
• 1.3.2 内质网应激在肌肉生长过程中的作用研究18-19
• 1.4 miRNAs和内质网应激19-22
• 1.4.1 miRNAs是内质网应激的调节器19-20
• 1.4.2 miRNAs是内质网应激的效应器20-22
• 1.5 本研究的目的和意义22
• 2 材料与方法22-36
• 2.1 实验材料22-28
• 2.1.1 质粒、菌株和细胞22-23
• 2.1.2 主要试剂23-25
• 2.1.3 主要仪器设备25-26
• 2.1.4 常用试剂配制26-28
• 2.1.5 主要分子生物学软件及数据库28
• 2.2 实验方法28-36
• 2.2.1 组织DNA提取28-29
• 2.2.2 细胞总RNA提取29
• 2.2.3 mRNA反转录29-30
• 2.2.4 miRNA反转录30
• 2.2.5 RT-qPCR30-31
• 2.2.6 猪GRP783’-UTR扩增及双荧光素酶载体构建31-33
• 2.2.7 细胞培养及转染33-35
• 2.2.8 细胞增殖和细胞活性检测35
• 2.2.9 C2C12细胞HE染色35-36
• 2.2.10 C2C12细胞和PMFs Hoechst 33342染色36
• 2.2.11 细胞内质网应激36
• 2.2.12 数据分析36
• 3 结果与分析36-49
• 3.1 C2C12细胞分化模型建立36-37
• 3.2 进化保守性分析以及成肌分化过程中miR-181a-5p的表达谱37-38
• 3.3 miR-181a-5p对ERS介导的凋亡信号通路和成肌分化的影响38-41
• 3.3.1 转染效率检测38-39
• 3.3.2 过表达miR-181a-5p激活ERS介导的凋亡途径并促进成肌分化39
• 3.3.3 抑制miR-181a-5p缓和ERS介导的凋亡途径并抑制成肌分化39-41
• 3.4 miR-181a-5p对肌纤维类型组成的影响41-42
• 3.5 miR-181a-5p对C2C12细胞增殖的影响42-43
• 3.6 ERS对成肌分化和miR-181a-5p表达量的影响43-44
• 3.7 miR-181a-5p调控ERS介导的细胞凋亡信号通路44-49
• 3.7.1 miR-181a-5p通过ERS介导的细胞凋亡通路促进C2C12细胞凋亡44-46
• 3.7.2 miR-181a-5p通过ERS介导的细胞凋亡通路促进PMFs细胞凋亡46-49
• 4 讨论49-52
• 4.1 miR-181a-5p在成肌分化过程中的调控作用49-50
• 4.2 ERS在成肌分化过程中的调控作用50
• 4.3 miR-181a-5p调控ERS介导的细胞凋亡信号通路50-52
• 5 结论52-53
• 参考文献53-59
• 致谢59-60
• 攻读学位期间发表的学术论文目录60

【相似文献】

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 邹萍;;血液系统恶性肿瘤细胞来源膜微粒的特征及生物学作用研究[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年

2 蒋争凡;卞婕;翟中和;;非细胞体系诱导小鼠肝细胞核凋亡的超微观察[A];第十次全国电子显微学会议论文集（Ⅰ）[C];1998年

3 陈卫银;祝彼得;刘福友;冯雪梅;;参芎滴丸对急性脑梗死模型大鼠神经细胞调亡的影响[A];中华医学会第十三次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2010年

4 谢晶日;李威;梁国英;杨丰源;;胃灵颗粒对胃癌前病变细胞调亡基因影响的实验研究[A];中华中医药学会脾胃病分会第十八次学术交流会论文汇编[C];2006年

5 綦淑芬;万瑞香;姚如勇;;扇贝多肽对Hela细胞在紫外线损伤下的保护作用[A];第五届全国自由基生物学与自由基医学学术讨论会论文摘要汇编[C];2000年

6 吴李君;裴蓓;王顺昌;王军;汤明礼;;砷和镉暴露诱导秀丽小杆线虫生殖腺细胞调亡及其信号通路研究[A];中国毒理学会第二届全国中青年学者科技论坛会议论文集[C];2007年

7 余珂;王敬贤;周炳升;;多溴联苯醚诱导人神经SK-N-SH细胞调亡的机理[A];湖北省暨武汉市生物化学与分子生物学学会第八届第十七次学术年会论文汇编[C];2007年

8 冉新泽;郑怀恩;王艾平;王锋超;韩京;;他汀对内皮细胞辐射损伤组织因子与细胞调亡的影响[A];中国毒理学会放射毒理专业委员会第七次、中国毒理学会免疫毒理专业委员会第五次、中国环境诱变剂学会致突专业委员会第二次、中国环境诱变剂学会致畸专业委员会第二次、中国环境诱变剂学会致癌专业委员会第二次全国学术会议论文汇编[C];2008年

9 崔承彬;闫少羽;蔡兵;赵庆春;姚新生;曲戈霞;;黑果黄皮Clausena dunniana Levl中咔唑生物碱类新细胞周期抑制剂及细胞调亡诱导剂的核磁共振研究[A];第十一届全国波谱学学术会议论文摘要集[C];2000年

10 吴耀辉;邹萍;;Sunrivin基因沉默对K562细胞调亡影响的研究[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 张田勘;细胞调亡的意义[N];中国人口报;2002年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 罗晓明;载药聚合物超细纤维作为肿瘤局部制剂的研究[D];西南交通大学;2014年

2 王石;黄芪甲苷促进血管新生的分子机制研究[D];南京中医药大学;2013年

3 宋杨;抗CD25单抗对肾移植患者调节性T细胞生存和功能改变影响的研究[D];复旦大学;2014年

4 罗忠光;CRL E3泛素连接酶靶向新药MLN4924在体内外杀伤肝癌细胞的作用及机制研究[D];复旦大学;2014年

5 肖林林;巨噬细胞对血管细胞的辐射旁效应及其分子机制研究[D];复旦大学;2014年

6 张峰;戊型肝炎病毒基因4型在PLC/PRF/5细胞中的培养及其特征研究[D];北京协和医学院;2014年

7 陈凤华;Tat-SmacN7融合肽对肿瘤细胞辐射增敏作用的研究[D];北京协和医学院;2013年

8 虞志新;Th17/Treg失衡及其与中性粒细胞相互影响在ARDS发病中的作用和机制研究[D];江苏大学;2015年

9 黄凌燕;STK33基因在下咽鳞状细胞癌发生发展中的作用机制研究[D];山东大学;2015年

10 袁媛;let-7c介导c-Myc基因调控逆转肝癌细胞多药耐药的机制研究[D];兰州大学;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 张晓娇;天然抗氧化剂对乳腺癌MCF-7/ADM细胞的耐药逆转作用及机制研究[D];河北联合大学;2014年

2 吕超绍;重组人干扰素γ(rhIFN-γ)对白血病K562细胞免疫逃逸的影响[D];昆明理工大学;2015年

3 汪建阳;Ang-(1-7)通过G蛋白偶联受体Mas对人肝癌HepG2细胞的影响研究[D];广西医科大学;2015年

4 任志涛;小檗碱对TGF-β1诱导A549细胞上皮间质转化和MRC-5细胞转分化及细胞信号通路相关蛋白的影响[D];北京协和医学院;2015年

5 杨晓姗;重组人p66Shc腺病毒和赖氨藤黄酸盐对肿瘤细胞的抑制作用及机制[D];北京协和医学院;2015年

6 万爱英;大分割照射生物效应实测数据与LQ公式计算数据的比较研究[D];北京协和医学院;2015年

7 邢晓萌;白藜芦醇对肺癌A549细胞的放射增敏作用及其机制研究[D];北京协和医学院;2015年

8 曹曰针;胞外泛素对Treg细胞免疫抑制活性的影响[D];复旦大学;2014年

9 张晓威;OSW-1与线粒体DNA缺失对肝癌细胞PI3K信号通路的影响[D];延边大学;2015年

10 余长松;胰高血糖素样肽-2对IPEG-J2细胞紧密连接表达与屏障功能的影响及其分子机制研究[D];四川农业大学;2014年

  本文关键词：miR-181a-5p和内质网应激对成肌分化的调控作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：319789