猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ3毒株N蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

发布时间：2021-05-24 17:58

　　为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）BJ3毒株N蛋白及制备抗N蛋白单克隆抗体,将N基因克隆至原核表达载体pColdⅠ,利用大肠杆菌BL21表达出了N蛋白。将IPTG诱导的细菌反复冻融3次后超声裂解,离心后分别收集上清和沉淀,用镍柱亲和层析分别纯化,SDS-PAGE结果显示,N蛋白主要以包涵体的形式存在。用纯化的N蛋白免疫小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,3次亚克隆后获取1株PRRSV N单抗,命名为F4。F4可与大肠杆菌BL21、不同PRRSV分离株表达的N蛋白发生特异性反应。本试验为进一步研究N蛋白的结构、功能及建立快速诊断PRRSV方法奠定了基础。 

【文章来源】：中国兽医科学. 2020,50(09)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 病毒、菌株、动物和细胞
    1.2 主要试剂
    1.3 引物
    1.4 目的片段的PCR扩增
    1.5 原核表达质粒的构建
    1.6 PRRSV N基因的原核表达及其N蛋白的纯化与鉴定
        1.6.1 PRRSV N基因的原核表达
        1.6.2 N蛋白的纯化与鉴定
    1.7 动物免疫
    1.8 N蛋白抗原性分析
        1.8.1 超免疫血清效价的ELISA检测
        1.8.2 超免疫血清的Western-blotting鉴定
    1.9 单克隆抗体的制备
        1.9.1 饲养层细胞的制备
        1.9.2 细胞的融合与筛选
    1.1 0 单克隆抗体的鉴定
        1.1 0. 1 单克隆抗体的Western-blotting
        1.1 0. 2 单克隆抗体腹水的制备
        1.1 0. 3 单克隆抗体稳定性的鉴定
        1.1 0. 4 单克隆抗体的IFA鉴定
2 结果
    2.1 目的基因的PCR与原核载体的构建
    2.2 PRRSV N基因的原核表达及其N蛋白的纯化与鉴定
        2.2.1 PRRSV N基因的原核表达
        2.2.2 N蛋白的纯化与鉴定
    2.3 N蛋白抗原性分析
        2.3.1 超免疫血清效价的测定
        2.3.2 超免疫血清的Western-blotting鉴定
    2.4 单克隆抗体的制备
        2.4.1 细胞融合
        2.4.2 杂交瘤细胞的筛选
    2.5 单克隆抗体的鉴定
        2.5.1 单克隆抗体的Western-blotting鉴定
        2.5.2 单克隆抗体腹水效价及稳定性的鉴定
        2.5.3 单克隆抗体的IFA鉴定
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪圆环病毒3型Cap蛋白的表达纯化及单克隆抗体的制备[J]. 陈桂华,孙媛,周玲,李迪,白杨,麦凯杰,高金铭,马静云.  中国兽医科学. 2019(01)
[2]猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的原核可溶性表达和间接ELISA抗体检测方法的初步建立[J]. 王俊,代军飞,马炳,丁耀忠,欧云文,刘永生,赵乐辉,张永光,张杰.  中国兽医科学. 2018(04)

硕士论文
[1]PRRSV贵州分离株GZZJ11、GZBJ12对解旋酶DDX6、Mov10的影响[D]. 张升波.贵州大学 2019



本文编号：3204611