猪四种腹泻病毒快速鉴别检测方法及猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究
发布时间：2021-05-24 20:16
猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、猪轮状病毒（PRoV）是仔猪常见的重要病毒性腹泻病原,临床上均以呕吐、厌食、腹泻、脱水为主要特征,仔猪的发病率和死亡率较高,给养猪业造成重大经济损失。尤其是PEDV变异株,是近年来仔猪腹泻的主要病原。由于临床症状极其相似,难以区分,只能借助实验室手段加以鉴别诊断。建立PEDV、TGEV、PDCoV及PRoV快速鉴别检测方法,开展PEDV分子流行病学研究,对仔猪病毒性腹泻的诊断和防控具有重要意义。1.PEDV、TGEV、PDCoV及PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用为鉴别检测PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,本研究分别针对PEDV N基因、TGEVM基因、PDCoVN基因和PRoVVP6基因设计特异性引物,经过优化反应条件,建立了同时检测并区分4种病毒的多重RT-PCR方法。结果,该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,与猪其他主要病毒无交叉反应,具有很强的特异性;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的最低检出下限分别为1.57×102
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1. 综述
1.1 猪流行性腹泻病毒概述
1.1.1 PEDV流行病学
1.1.2 PEDV基本特征
1.1.3 PEDV基因组结构与功能
1.1.4 PEDV主要编码蛋白及其功能
1.2 猪传染性胃肠炎病毒概述
1.3 猪轮状病毒概述
1.4 猪Delta冠状病毒概述
1.5 PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV检测技术及其研究进展
1.5.1 免疫荧光法(IF)
1.5.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)
1.5.3 免疫组织化学(IHC)
1.5.4 病毒分离鉴定
1.5.5 胶体金免疫层析技术
1.5.6 环介导等温扩增技术(LAMP)
1.5.7 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)
1.5.8 荧光定量PCR检测法
1.6 研究目的及意义
1.7 技术路线
2. PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用
2.1 试验材料
2.1.1 病毒株
2.1.2 主要试剂及仪器
2.2 试验方法
2.2.1 引物设计与合成
2.2.2 重组质粒标准品的构建
2.2.2.1 腹泻病料的处理
2.2.2.2 RNA的反转录及PCR的扩增
2.2.2.3 目的基因的纯化
2.2.2.4 目的基因的克隆转化
2.2.2.5 重组质粒的制备
2.2.3 多重RT-PCR反应条件的优化
2.2.4 多重RT-PCR的特异性、敏感性、重复性试验
2.2.5 多重RT-PCR方法的临床应用
2.3 结果与分析
2.3.1 重组质粒标准品的构建
2.3.2 多重RT-PCR退火温度的优化
2.3.3 引物浓度的优化
2.3.4 循环数的优化
2.3.5 多重RT-PCR反应条件的确定
2.3.6 多重RT-PCR特异性试验
2.3.7 多重RT-PCR敏感性试验
2.3.7.1 单重RT-PCR敏感性试验
2.3.7.2 多重RT-PCR敏感性试验
2.3.8 多重RT-PCR重复性试验
2.3.9 多重RT-PCR方法的临床应用
2.4 讨论与结论
3. PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用
3.1 实验材料与方法
3.1.1 临床病料和病毒株
3.1.2 主要试剂及仪器
3.1.3 引物和TaqMan探针的设计
3.1.4 核酸的抽提和RNA反转录
3.1.5 重组质粒标准品的制备
3.1.6 反应条件的优化和标准曲线的制作
3.1.7 多重TaqMan荧光定量PCR特异性、敏感性、重复性试验
3.1.8 多重TaqMan荧光定量PCR方法的临床应用
3.2 结果
3.2.1 重组质粒标准品的构建
3.2.2 TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件的确定
3.2.3 TaqMan荧光定量RT-PCR标准曲线的绘制
3.2.4 特异性分析
3.2.5 敏感性分析
3.2.6 重复性分析
3.2.7 临床样品的检测结果
3.3 讨论
4. 2017-2019年广西PEDV分子流行病学研究
4.1 材料与方法
4.1.1 病料及病毒株
4.1.2 主要试剂及仪器设备
4.1.3 引物设计与合成
4.1.4 腹泻病料的处理
4.1.5 cDNA的合成及PCR的扩增
4.1.6 目的基因的纯化
4.1.7 目的基因的克隆转化
4.1.8 序列分析
4.2 结果与分析
4.2.1 病料的检测
4.2.2 S、M、N基因序列
4.2.3 S、M、N基因同源性分析
4.2.3.1 PEDV S基因同源性分析
4.2.3.2 PEDV M基因同源性分析
4.2.3.3 PEDV N基因同源性分析
4.2.4 遗传进化树的绘制
4.2.4.1 PEDV S基因序列分析和遗传进化树分析
4.2.4.2 PEDV M基因遗传进化树分析
4.2.4.3 PEDV N基因序列分析和遗传进化树分析
4.2.5 PEDV S1氨基酸序列分析
4.2.6 S、M、N基因进化速率的分析
4.3 讨论
5. 结论
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间发表的论文及专利情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒的鉴定及其S基因的序列分析[J]. 王婧,刁小龙,杨海峰,孙志雯,陈晓兰. 西北农业学报. 2019(01)
[2]猪流行性腹泻病毒检测方法的研究进展[J]. 李亚兰,袁晓民,湛洋,杨凌宸,胡意,谭磊,刘谭彬,郭时印,王爱兵. 中国兽医科学. 2019(03)
[3]猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒A多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 李军,蔡良语,陈兵,刘建利,孙洁,陈书琨,林庆燕,陶虹,吴绍强,卢体康,陈金顶,秦智锋. 中国预防兽医学报. 2018(09)
[4]猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）RT-PCR检测方法的建立与应用[J]. 刘浩宇,黄小波,李成,刘志鹏,吴盈盈,赵玉佳,曹三杰,文心田,文翼平,伍锐,赵勤,刘凤华. 农业生物技术学报. 2018(09)
[5]猪流行性腹泻病毒检测技术研究进展[J]. 芮聪杰,潘孝成,沈学怀,赵瑞宏,张丹俊. 安徽农业科学. 2018(25)
[6]猪PEDV与PDCOV二重RT-PCR检测方法的建立[J]. 孔维欢,王晶晶,万鹏程,石国庆. 生物技术通报. 2018(11)
[7]猪流行性腹泻研究概况[J]. 周宏专. 动物医学进展. 2018(07)
[8]贵州省PEDV与PoRV分子流行病学调查[J]. 丁尊俄,冯旭芳,张双翔,何贤海,胡兴义,张海,王开功,文明,程振涛,李晨,蒲翠敏,罗引幸,刘丽娟,周碧君. 基因组学与应用生物学. 2018(06)
[9]猪流行性腹泻的疫苗研究进展[J]. 郭倩妤,汤德元,曾智勇,胡玲玲,龙冬梅,廖少山,刘巧玲. 猪业科学. 2018(04)
[10]猪丁型冠状病毒与猪流行性腹泻病毒双重实时荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用[J]. 罗尚星,范京惠,刘宝京,师乾凯,侯林杉,左玉柱. 畜牧兽医学报. 2018(04)
博士论文
[1]猪流行性腹泻病毒流行株的分离鉴定及生物学特性研究[D]. 赵鹏伟.中国农业大学 2018
[2]河南省猪流行性腹泻病毒遗传进化分析及免疫学检测方法的建立[D]. 李任峰.西北农林科技大学 2016
硕士论文
[1]2015-2016年中国猪流行性腹泻病毒S1基因分子流行病学调查及病毒分离与鉴定[D]. 王恩雨.黑龙江八一农垦大学 2018
[2]四种猪冠状病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用[D]. 杨艳楠.吉林大学 2018
[3]PEDV分子流行病学分析及间接ELISA检测方法的改进与应用[D]. 张鸿鑫.河南农业大学 2018
[4]河南省部分地区猪腹泻类冠状病毒流行病学调查及PEDV遗传进化分析[D]. 崔新格.河南农业大学 2018
[5]猪流行性腹泻病毒鉴别检测方法的建立及应用研究[D]. 龙飞翔.广西大学 2017
[6]猪病毒性腹泻PCR检测方法建立与流行病学调查[D]. 冯旭芳.贵州大学 2016
[7]猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重荧光RT-PCR检测方法的建立[D]. 许梦怡.扬州大学 2016
[8]猪流行性腹泻病毒的流行病学调查及快速检测方法的初步建立[D]. 赵振鹏.扬州大学 2016
[9]猪腹泻相关病毒多重和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[D]. 吴洋.东北农业大学 2014
[10]猪流行性腹泻病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[D]. 田建兴.南京农业大学 2009
本文编号：3204797
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1. 综述
1.1 猪流行性腹泻病毒概述
1.1.1 PEDV流行病学
1.1.2 PEDV基本特征
1.1.3 PEDV基因组结构与功能
1.1.4 PEDV主要编码蛋白及其功能
1.2 猪传染性胃肠炎病毒概述
1.3 猪轮状病毒概述
1.4 猪Delta冠状病毒概述
1.5 PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV检测技术及其研究进展
1.5.1 免疫荧光法(IF)
1.5.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)
1.5.3 免疫组织化学(IHC)
1.5.4 病毒分离鉴定
1.5.5 胶体金免疫层析技术
1.5.6 环介导等温扩增技术(LAMP)
1.5.7 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)
1.5.8 荧光定量PCR检测法
1.6 研究目的及意义
1.7 技术路线
2. PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用
2.1 试验材料
2.1.1 病毒株
2.1.2 主要试剂及仪器
2.2 试验方法
2.2.1 引物设计与合成
2.2.2 重组质粒标准品的构建
2.2.2.1 腹泻病料的处理
2.2.2.2 RNA的反转录及PCR的扩增
2.2.2.3 目的基因的纯化
2.2.2.4 目的基因的克隆转化
2.2.2.5 重组质粒的制备
2.2.3 多重RT-PCR反应条件的优化
2.2.4 多重RT-PCR的特异性、敏感性、重复性试验
2.2.5 多重RT-PCR方法的临床应用
2.3 结果与分析
2.3.1 重组质粒标准品的构建
2.3.2 多重RT-PCR退火温度的优化
2.3.3 引物浓度的优化
2.3.4 循环数的优化
2.3.5 多重RT-PCR反应条件的确定
2.3.6 多重RT-PCR特异性试验
2.3.7 多重RT-PCR敏感性试验
2.3.7.1 单重RT-PCR敏感性试验
2.3.7.2 多重RT-PCR敏感性试验
2.3.8 多重RT-PCR重复性试验
2.3.9 多重RT-PCR方法的临床应用
2.4 讨论与结论
3. PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用
3.1 实验材料与方法
3.1.1 临床病料和病毒株
3.1.2 主要试剂及仪器
3.1.3 引物和TaqMan探针的设计
3.1.4 核酸的抽提和RNA反转录
3.1.5 重组质粒标准品的制备
3.1.6 反应条件的优化和标准曲线的制作
3.1.7 多重TaqMan荧光定量PCR特异性、敏感性、重复性试验
3.1.8 多重TaqMan荧光定量PCR方法的临床应用
3.2 结果
3.2.1 重组质粒标准品的构建
3.2.2 TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件的确定
3.2.3 TaqMan荧光定量RT-PCR标准曲线的绘制
3.2.4 特异性分析
3.2.5 敏感性分析
3.2.6 重复性分析
3.2.7 临床样品的检测结果
3.3 讨论
4. 2017-2019年广西PEDV分子流行病学研究
4.1 材料与方法
4.1.1 病料及病毒株
4.1.2 主要试剂及仪器设备
4.1.3 引物设计与合成
4.1.4 腹泻病料的处理
4.1.5 cDNA的合成及PCR的扩增
4.1.6 目的基因的纯化
4.1.7 目的基因的克隆转化
4.1.8 序列分析
4.2 结果与分析
4.2.1 病料的检测
4.2.2 S、M、N基因序列
4.2.3 S、M、N基因同源性分析
4.2.3.1 PEDV S基因同源性分析
4.2.3.2 PEDV M基因同源性分析
4.2.3.3 PEDV N基因同源性分析
4.2.4 遗传进化树的绘制
4.2.4.1 PEDV S基因序列分析和遗传进化树分析
4.2.4.2 PEDV M基因遗传进化树分析
4.2.4.3 PEDV N基因序列分析和遗传进化树分析
4.2.5 PEDV S1氨基酸序列分析
4.2.6 S、M、N基因进化速率的分析
4.3 讨论
5. 结论
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间发表的论文及专利情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒的鉴定及其S基因的序列分析[J]. 王婧,刁小龙,杨海峰,孙志雯,陈晓兰. 西北农业学报. 2019(01)
[2]猪流行性腹泻病毒检测方法的研究进展[J]. 李亚兰,袁晓民,湛洋,杨凌宸,胡意,谭磊,刘谭彬,郭时印,王爱兵. 中国兽医科学. 2019(03)
[3]猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒A多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 李军,蔡良语,陈兵,刘建利,孙洁,陈书琨,林庆燕,陶虹,吴绍强,卢体康,陈金顶,秦智锋. 中国预防兽医学报. 2018(09)
[4]猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）RT-PCR检测方法的建立与应用[J]. 刘浩宇,黄小波,李成,刘志鹏,吴盈盈,赵玉佳,曹三杰,文心田,文翼平,伍锐,赵勤,刘凤华. 农业生物技术学报. 2018(09)
[5]猪流行性腹泻病毒检测技术研究进展[J]. 芮聪杰,潘孝成,沈学怀,赵瑞宏,张丹俊. 安徽农业科学. 2018(25)
[6]猪PEDV与PDCOV二重RT-PCR检测方法的建立[J]. 孔维欢,王晶晶,万鹏程,石国庆. 生物技术通报. 2018(11)
[7]猪流行性腹泻研究概况[J]. 周宏专. 动物医学进展. 2018(07)
[8]贵州省PEDV与PoRV分子流行病学调查[J]. 丁尊俄,冯旭芳,张双翔,何贤海,胡兴义,张海,王开功,文明,程振涛,李晨,蒲翠敏,罗引幸,刘丽娟,周碧君. 基因组学与应用生物学. 2018(06)
[9]猪流行性腹泻的疫苗研究进展[J]. 郭倩妤,汤德元,曾智勇,胡玲玲,龙冬梅,廖少山,刘巧玲. 猪业科学. 2018(04)
[10]猪丁型冠状病毒与猪流行性腹泻病毒双重实时荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用[J]. 罗尚星,范京惠,刘宝京,师乾凯,侯林杉,左玉柱. 畜牧兽医学报. 2018(04)
博士论文
[1]猪流行性腹泻病毒流行株的分离鉴定及生物学特性研究[D]. 赵鹏伟.中国农业大学 2018
[2]河南省猪流行性腹泻病毒遗传进化分析及免疫学检测方法的建立[D]. 李任峰.西北农林科技大学 2016
硕士论文
[1]2015-2016年中国猪流行性腹泻病毒S1基因分子流行病学调查及病毒分离与鉴定[D]. 王恩雨.黑龙江八一农垦大学 2018
[2]四种猪冠状病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用[D]. 杨艳楠.吉林大学 2018
[3]PEDV分子流行病学分析及间接ELISA检测方法的改进与应用[D]. 张鸿鑫.河南农业大学 2018
[4]河南省部分地区猪腹泻类冠状病毒流行病学调查及PEDV遗传进化分析[D]. 崔新格.河南农业大学 2018
[5]猪流行性腹泻病毒鉴别检测方法的建立及应用研究[D]. 龙飞翔.广西大学 2017
[6]猪病毒性腹泻PCR检测方法建立与流行病学调查[D]. 冯旭芳.贵州大学 2016
[7]猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重荧光RT-PCR检测方法的建立[D]. 许梦怡.扬州大学 2016
[8]猪流行性腹泻病毒的流行病学调查及快速检测方法的初步建立[D]. 赵振鹏.扬州大学 2016
[9]猪腹泻相关病毒多重和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[D]. 吴洋.东北农业大学 2014
[10]猪流行性腹泻病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[D]. 田建兴.南京农业大学 2009
本文编号：3204797
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