CRISPR/Cas9介导的GLUT2基因编辑体系的初探
发布时间：2021-05-25 19:06
GLUT2是鸡肠道主要的糖类转运载体,其表达直接影响着糖类物质的吸收。而其生物学功能的实现受到了多个转录因子的调控,如转录因子USF1、GATA2。但其转录因子结合位点尚不清楚。为了确定转录因子结合位点,本试验选用一种新的技术手段CRISPR/Cas9来研究。CRISPR/Cas9系统是基于细菌抵御外源核酸入侵的免疫防御机制改造而来的一种新兴的基因编辑技术。它是一种依赖于RNA的,可定点编辑特定基因序列的方式。自2013年以来,已成功应用于多种动植物及细胞中。目前CRISPR/Cas9技术在鸡体内的应用尚少见报道。本试验的目的在于搭建鸡细胞中的Cas9编辑平台,并以此为基础,初步探索其在鸡体内定点敲除中的应用。细胞中的Cas9编辑平台主要由三部分组成,分别为体外鸡细胞的培养,打靶载体的构建及转染。本试验通过大量的重复实验对上述三个步骤进行摸索,初步建立了一套较为合适的实验条件。首先摸索建立了体外分离培养鸡CEF的基本条件,分离培养、传代、冻存复苏及生长状况的测定,以及对不同制备方法的比较。然后对打靶载体构建条件的摸索,以px458载体为基本骨架,针对转录因子的两个预期结合位点,构建px...
【文章来源】：山西农业大学山西省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
1.文献综述
1.1 基因组编辑
1.1.1 ZFNs技术
1.1.2 TALEN技术
1.1.3 CRISPR/Cas技术
1.1.3.1 CRISPR/Cas技术简介
1.1.3.2 CRISPR/Cas9系统研究历史
1.1.3.3 CRISPR/Cas系统组成
1.1.3.4 CRISPR/Cas的分类
1.1.3.5 CRISPR/Cas Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型系统的作用机理
1.1.3.6 CRISPR/Cas9系统的作用过程
1.1.3.7 CRISPR/Cas9系统的应用
1.1.3.8 CRISPR/Cas系统的利弊
1.2 鸡体内糖营养转运蛋白及其转录调控因子
1.2.1 糖类转运蛋白GLUT2
1.2.2 转录调控因子
1.2.2.1 转录因子GATA2
1.2.2.2 转录因子USF1
1.3 本研究的目的、内容和意义
2.材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 试验动物
2.1.2 试验仪器设备
2.1.3 主要试验试剂
2.1.4 常用试剂的配制
2.1.5 引物设计及其他分析软件
2.1.6 细胞系与质粒
2.2 试验方法
2.2.1 生物信息学分析
2.2.2 构建Cas9打靶载体
2.2.2.1 设计识别靶点的sgRNA
2.2.2.2 sgRNA两条单链的合成
2.2.2.3 两条单链sgRNA退火成双链及磷酸化处理
2.2.2.4 双链sRNA与px458载体连接
2.2.2.5 px458-sgRNA重组质粒的提取
2.2.3 CEF细胞的分离培养
2.2.3.1 鸡胚体的前处理
2.2.3.2 组织块培养法
2.2.3.3 胰蛋白酶消化法
2.2.3.4 鸡小肠来源的成纤维细胞的制备
2.2.3.5 次代CEF的制备
2.2.3.6 CEF细胞的冷冻保存与复苏
2.2.3.7 鸡CEF形态学性状检测
2.2.4 测定基因GLUT2在原代CEF细胞中的初始表达量
2.2.4.1 鸡CEF细胞RNA的提取
2.2.4.2 将所提RNA反转录成cDNA
2.2.4.3 测定cDNA的初始表达量
2.2.4.4 表达量的数据处理
2.2.5 px458-sgRNA(GLUT2)表达载体转染细胞
3.试验结果
3.1 生物信息学分析结果
3.2 构建px458-sgRNA(GLUT2)打靶载体
3.2.1 sgRNA双链的形成
3.2.2 线性化原载体px458
3.2.3 PCR鉴别阳性重载体
3.2.4 DNA测序鉴定px458-GLUT2打靶载体
3.3 分离培养原代鸡CEF
3.3.1 组织块培养法
3.3.2 胰蛋白酶消化法
3.3.3 不同来源鸡胚培养的原代CEF的形态观察
3.3.4 次代CEF细胞的形态学观察
3.3.5 原代、次代CEF细胞生长曲线的测定
3.3.6 成纤维细胞的形态学鉴定
3.4 测定基因GLUT2在原代CEF细胞中的初始表达量
3.4.1 RNA提取结果
3.4.2 GLUT2基因在CEF中的表达量
3.5 px458-sgRNA(GLUT2)打靶载体转染细胞
4.讨论
4.1 Cas9靶点选取
4.2 影响体外分离培养CEF的主要因素
5.结论
参考文献
Abstract
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]紫杉醇缓释剂型对人胚肺成纤维细胞增殖的抑制作用[J]. 孔颖颖,张杰,王婷,赵志刚,李新刚,邱小建,王玉玲. 临床肺科杂志. 2014(10)
[2]鸡胚三类组织体外培养细胞的生物学特性分析[J]. 邰大鹏,刘坤,特日格乐,侯东霞,李瑶,李煜. 中国细胞生物学学报. 2011(09)
[3]CRISPR-Cas系统与细菌和噬菌体的共进化[J]. 李铁民,杜波. 遗传. 2011(03)
[4]利用不同方法培养鸡胚成纤维细胞的研究[J]. 刘洪斌,孙心,郑桂军. 中国兽药杂志. 2009(12)
[5]哺乳动物体细胞核移植研究进展[J]. 于洋,王柳,周琪. 生命科学. 2009(05)
[6]水稻WRKY转录调控因子基因功能研究进展[J]. 宋钰,荆邵娟,余迪求. 中国水稻科学. 2009(05)
硕士论文
[1]大骨鸡、青壳蛋鸡成纤维细胞库的建立及生物学特性研究[D]. 跃华.内蒙古农业大学 2006
[2]牛成纤维细胞库的建立及生物学特性研究[D]. 郭瑜.四川农业大学 2005
本文编号：3205853
【文章来源】：山西农业大学山西省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
1.文献综述
1.1 基因组编辑
1.1.1 ZFNs技术
1.1.2 TALEN技术
1.1.3 CRISPR/Cas技术
1.1.3.1 CRISPR/Cas技术简介
1.1.3.2 CRISPR/Cas9系统研究历史
1.1.3.3 CRISPR/Cas系统组成
1.1.3.4 CRISPR/Cas的分类
1.1.3.5 CRISPR/Cas Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型系统的作用机理
1.1.3.6 CRISPR/Cas9系统的作用过程
1.1.3.7 CRISPR/Cas9系统的应用
1.1.3.8 CRISPR/Cas系统的利弊
1.2 鸡体内糖营养转运蛋白及其转录调控因子
1.2.1 糖类转运蛋白GLUT2
1.2.2 转录调控因子
1.2.2.1 转录因子GATA2
1.2.2.2 转录因子USF1
1.3 本研究的目的、内容和意义
2.材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 试验动物
2.1.2 试验仪器设备
2.1.3 主要试验试剂
2.1.4 常用试剂的配制
2.1.5 引物设计及其他分析软件
2.1.6 细胞系与质粒
2.2 试验方法
2.2.1 生物信息学分析
2.2.2 构建Cas9打靶载体
2.2.2.1 设计识别靶点的sgRNA
2.2.2.2 sgRNA两条单链的合成
2.2.2.3 两条单链sgRNA退火成双链及磷酸化处理
2.2.2.4 双链sRNA与px458载体连接
2.2.2.5 px458-sgRNA重组质粒的提取
2.2.3 CEF细胞的分离培养
2.2.3.1 鸡胚体的前处理
2.2.3.2 组织块培养法
2.2.3.3 胰蛋白酶消化法
2.2.3.4 鸡小肠来源的成纤维细胞的制备
2.2.3.5 次代CEF的制备
2.2.3.6 CEF细胞的冷冻保存与复苏
2.2.3.7 鸡CEF形态学性状检测
2.2.4 测定基因GLUT2在原代CEF细胞中的初始表达量
2.2.4.1 鸡CEF细胞RNA的提取
2.2.4.2 将所提RNA反转录成cDNA
2.2.4.3 测定cDNA的初始表达量
2.2.4.4 表达量的数据处理
2.2.5 px458-sgRNA(GLUT2)表达载体转染细胞
3.试验结果
3.1 生物信息学分析结果
3.2 构建px458-sgRNA(GLUT2)打靶载体
3.2.1 sgRNA双链的形成
3.2.2 线性化原载体px458
3.2.3 PCR鉴别阳性重载体
3.2.4 DNA测序鉴定px458-GLUT2打靶载体
3.3 分离培养原代鸡CEF
3.3.1 组织块培养法
3.3.2 胰蛋白酶消化法
3.3.3 不同来源鸡胚培养的原代CEF的形态观察
3.3.4 次代CEF细胞的形态学观察
3.3.5 原代、次代CEF细胞生长曲线的测定
3.3.6 成纤维细胞的形态学鉴定
3.4 测定基因GLUT2在原代CEF细胞中的初始表达量
3.4.1 RNA提取结果
3.4.2 GLUT2基因在CEF中的表达量
3.5 px458-sgRNA(GLUT2)打靶载体转染细胞
4.讨论
4.1 Cas9靶点选取
4.2 影响体外分离培养CEF的主要因素
5.结论
参考文献
Abstract
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]紫杉醇缓释剂型对人胚肺成纤维细胞增殖的抑制作用[J]. 孔颖颖,张杰,王婷,赵志刚,李新刚,邱小建,王玉玲. 临床肺科杂志. 2014(10)
[2]鸡胚三类组织体外培养细胞的生物学特性分析[J]. 邰大鹏,刘坤,特日格乐,侯东霞,李瑶,李煜. 中国细胞生物学学报. 2011(09)
[3]CRISPR-Cas系统与细菌和噬菌体的共进化[J]. 李铁民,杜波. 遗传. 2011(03)
[4]利用不同方法培养鸡胚成纤维细胞的研究[J]. 刘洪斌,孙心,郑桂军. 中国兽药杂志. 2009(12)
[5]哺乳动物体细胞核移植研究进展[J]. 于洋,王柳,周琪. 生命科学. 2009(05)
[6]水稻WRKY转录调控因子基因功能研究进展[J]. 宋钰,荆邵娟,余迪求. 中国水稻科学. 2009(05)
硕士论文
[1]大骨鸡、青壳蛋鸡成纤维细胞库的建立及生物学特性研究[D]. 跃华.内蒙古农业大学 2006
[2]牛成纤维细胞库的建立及生物学特性研究[D]. 郭瑜.四川农业大学 2005
本文编号：3205853
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