动物衣原体TaqMan-MGB探针多重荧光定量PCR方法的建立及应用

发布时间：2021-06-03 19:01

　　动物衣原体病(（Chlamydiosis）是由各类衣原体（Chlamydia）感染哺乳动物、禽类等动物所发生的一类十分重要的自然疫源性传染病。该病呈地方流行,常造成较大的危害及经济损失。目前针对的衣原体的检测方法有细胞培养法、间接血凝试验（1HA）、直接染色观察等方法,但以上检测方法对于快速准确的检测衣原体尚存在较大的局限,如细胞培养法容易受到支原体的污染、灵敏度较低；间接血.凝试验虽然操作比较简单,但批次间差异较大、阳性检出率较低；直接染色观察灵敏度较低。因此,急需建立一种快速、简捷、特异、灵敏、稳定性好的检测方法,用于衣原体的早期诊断、疫情监控、流行病学调查等。为了保障畜牧业健康发展,加快现代畜牧业前进步伐,本研究以荧光定量PCR方法为技术基础,建立了一种能单管同时鉴别三种动物衣原体的TaqMan-MGB探针多重荧光定量PCR方法,该方法特异、灵敏且稳定性良好。主要研究内容包括以下几方面：1、通过对GenBank中衣原体科的9种衣原体主要外膜蛋白序列进行比对分析,应用Primer Express3.0生物学软件设计了3对特异的引物,3条探针和1对通用引物。采用通用引物进行PCR扩增... 

【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 文献综述
    1.1 衣原体科的简介
        1.1.1 主要致病衣原体
        1.1.2 病原学
        1.1.3 衣原体的基因组学
        1.1.4 衣原体蛋白组学
    1.2 衣原体疫苗研究进展
        1.2.1 弱毒疫苗
        1.2.2 灭活疫苗
        1.2.3 核酸疫苗
    1.3 动物衣原体病的诊断学方法的研究进展
        1.3.1 直接染色观察
        1.3.2 酶免检测
        1.3.3 细胞培养的方法
        1.3.4 间接血凝试验
        1.3.5 胶体金技术
        1.3.6 补体结合试验
        1.3.7 酶联免疫吸附试验
        1.3.8 药敏试验
        1.3.9 DNA芯片技术
    1.4 聚合酶链反应(PCR)的研究
    1.5 TaqMan—MGB探针的应用
第2章 引言
    2.1 研究目的及意义
    2.2 研究内容
        2.2.1 基因组序列的分析、引物与探针的设计
        2.2.2 建立三种衣原体的单重荧光定量PCR方法
        2.2.3 多重荧光定量PCR方法的建立
        2.2.4 所建立的多重荧光定量PCR方法与其它方法的比较
    2.3 多重荧光定量PCR方法的建立的技术路线
第3章 单重荧光定量PCR方法的优化及建立
    3.1 材料
        3.1.1 标准菌株、细胞株
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器
        3.1.4 试剂配制
    3.2 方法
        3.2.1 序列分析与引物设计
        3.2.2 衣原体DNA基因组的提取
        3.2.3 目的基因的扩增
        3.2.4 PCR产物回收纯化
        3.2.5 目的片段的克隆
        3.2.6 单重荧光PCR反应条件的优化
            3.2.6.1 单重突光定量PCR反应中探计浓度的优化
            3.2.6.2 单重荧光PCR反应中引物浓度优化
            3.2.6.3 单重焚光PCR反应体系中Tm值的优化
        3.2.7 单重荧光定量PCR特异性的试验
        3.2.8 单重荧光定量PCR灵敏度试验
        3.2.9 单重荧光定量PCR标准曲线的构建
    3.3 结果与分析
        3.3.1 衣原体科已知序列的保守性和特异性
        3.3.2 衣原体核酸的扩增结果
        3.3.3 重组质粒的PCR鉴定结果
        3.3.4 重组质粒测序结果及序列分析
        3.3.5 三种重组阳性质粒OD值的测定结果
        3.3.6 单重荧光定量PCR反应条件优化结果
            3.3.6.1 单重荧光定量PCR探针优化的结果
            3.3.6.2 单重焚光定量PCR引物优化的结果
            3.3.6.3 单重劳光定量PCR反应体系中Tm值优化结果
        3.3.7 单重荧光定量PCR特异性的鉴定
        3.3.8 单重荧光定量PCR灵敏度试验
        3.3.9 单重荧光定量PCR标准曲线的构建
    3.4 小结
第4章 多重荧光定量PCR方法的建立及应用
    4.1 材料
        4.1.1 实验菌株
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 主要仪器
        4.1.4 试剂配制
    4.2 多重荧光定量PCR方法的建立
        4.2.1 多重荧光定量PCR反应条件的优化
        4.2.2 多重荧光定量PCR特异性的试验
        4.2.3 多重荧光定量PCR灵敏度试验
        4.2.4 多重荧光定量PCR稳定性试验
        4.2.5 多重荧光定量PCR标准曲线的构建
    4.3 结果
        4.3.1 多重荧光PCR反应中引物浓度的优化的试验结果
        4.3.2 多重荧光PCR反应探针浓度的优化的试验结果
        4.3.3 多重荧光PCR反应体系中Tm值的优化
        4.3.4 多重荧光定量PCR特异性试验结果
        4.3.5 多重荧光定量PCR方法灵敏度试验结果
        4.3.6 多重荧光定量PCR稳定性试验结果
        4.3.7 标准曲线的构建试验结果
    4.4 多重荧光定量PCR方法的应用
        4.4.1 临床应用
        4.4.2 结果与分析
    4.5 小结
    4.6 讨论
        4.6.1 三种衣原体单重荧光定量PCR方法的建立
        4.6.2 衣原体多重荧光定量PCR方法的建立
        4.6.3 衣原体多重荧光定量PCR方法的评价
        4.6.4 衣原体多重荧光定量PCR方法的临床应用的评价
        4.6.5 后续工作建议及展望
参考文献
缩略词表
致谢
个人简历、在学校期间发表的学术论文及取得研究成果


【参考文献】：
期刊论文
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[3]鹦鹉热嗜性衣原体特异性TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J]. 冯悦,张忠华,龚福明,柳陈坚.  中国人兽共患病学报. 2010(11)
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[5]荧光定量聚合酶链反应检测解脲支原体及沙眼衣原体[J]. 陈燚琼.  检验医学与临床. 2009(04)
[6]流产嗜性衣原体病诊断的研究进展[J]. 吕小娇,梅仕林,栗绍文,姚宝安.  黑龙江畜牧兽医. 2008(11)
[7]猪衣原体病的临床诊治[J]. 李春燕.  畜牧兽医科技信息. 2008(06)
[8]沙眼衣原体临床株体外药物敏感性检测[J]. 尚淑贤,钟铭英,张津萍,赵建斌,王千秋.  中华皮肤科杂志. 2007(12)
[9]动物衣原体病诊断方法及疫苗研究进展[J]. 李忠军.  动物医学进展. 2007(08)
[10]多个规模猪场衣原体病调查研究[J]. 温福华,洪敏,林青.  福建畜牧兽医. 2007(03)



本文编号：3211070