猪支原体肺炎LAMP-LFD快速检测方法的建立及初步应用

发布时间：2021-06-05 10:58

　　旨在采用环介导等温扩增（LAMP）和横向流动试纸条（LFD）相结合的方法,建立一种快速、特异,过程可视化的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）检测方法。针对猪肺炎支原体（Mhp）P36基因设计5套特异性引物和1条异硫氰酸荧光素（FITC）标记的探针,进行LAMP扩增反应。将生物素标记的LAMP产物与FITC标记的探针进行特异性杂交,并使用横向流动试纸条完成扩增产物的检测。经优化,LAMP最佳反应条件为65℃,反应15 min,从基因组DNA提取到LFD结果判断只需40 min左右,比常规PCR技术缩短近2 h。LAMP-LFD可特异性地检出猪肺炎支原体（Mhp）,对猪鼻支原体（Mhr）及猪圆环病毒（PCV）等常见猪病病原的检测结果为阴性。灵敏性试验表明,LAMP-LFD对Mhp的检测灵敏度为1×10⁰个拷贝DNA,是普通PCR的1 000倍。利用本方法可从采集的88份临床疑似病料样品中检测到64份阳性,国标PCR方法可检测到56份阳性,符合率可达90.9%。综上,本研究建立的LAMP-LFD方法可特异、准确地应用于Mhp的检测,... 

【文章来源】：畜牧兽医学报. 2020,51(06)北大核心CSCD

【文章页数】：10 页

【部分图文】：

LAMP-LFD特异性检测结果

以Mhp基因组DNA为模板进行LAMP反应,反应产物分别用琼脂糖凝胶电泳、SYBR Green Ⅰ、LFD进行检测,验证该方法的可行性。结果显示,通过琼脂糖凝胶电泳,阳性出现明显的阶梯状条带,而阴性对照无条带(图5A);SYBR Green Ⅰ通过肉眼可见阳性显现黄绿色,而阴性为橘黄色,在紫外分析仪下,阳性发出强烈的黄绿色荧光,而阴性呈现橘色(图5B);LFD显示,阳性在检测线和控制线区域内出现2条红线,而阴性仅在控制线出现1条红线(图5C)。因此,LAMP-LFD检测方法可行。图2 LAMP反应条件优化

LAMP反应条件优化

【参考文献】：
期刊论文
[1]快速直接PCR检测猪肺炎支原体方法的建立及其应用[J]. 徐引弟,张青娴,王治方,焦文强,李海利,朱文豪,王克领.  养猪. 2019(06)
[2]猪支原体肺炎临床诊断及综合防治[J]. 赵国胜.  畜牧兽医科学(电子版). 2019(16)
[3]一起猪支原体肺炎的诊断与防治[J]. 许立阳.  当代畜禽养殖业. 2019(07)
[4]猪支原体肺炎诊断及防治[J]. 刘建民.  畜牧兽医科学(电子版). 2019(11)
[5]猪支原体肺炎诊断与防治措施[J]. 刘金媛.  畜牧兽医科学(电子版). 2019(07)
[6]环介导等温扩增联合横向流动试纸条检测简单异尖线虫/派氏异尖线虫方法的建立[J]. 乔艳,周前进,李孝军,苗亮,陈炯.  海洋与湖沼. 2019(02)
[7]绵羊肺炎支原体环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测方法的建立[J]. 张洁,曹军军,祝明松,杨亚军,吴文星,王璐,石峰.  动物医学进展. 2019(03)
[8]环介导等温扩增技术与横向流动试纸条法快速检测鸡贫血病毒的研究[J]. 李秀梅,石瑜,朱雅宁,袁雪涛,杨爱华,杨颖.  中国动物传染病学报. 2018(01)
[9]环介导等温扩增技术与横向流动试纸条法快速检测布鲁氏杆菌[J]. 李秀梅,梁智选,李颖,郭恋,王健春,赵静,王红军.  食品与生物技术学报. 2017(12)
[10]不同猪支原体肺炎活疫苗菌株P46和P97基因序列差异性分析[J]. 武昱孜,邢宪平,韦艳娜,熊祺琰,冯志新,邵国青.  畜牧兽医学报. 2017(12)



本文编号：3212037