基于假病毒的猪流行性腹泻病毒S1蛋白细胞定位研究
发布时间：2021-06-07 05:28
猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于冠状病毒属,冠状病毒科,能够导致仔猪严重腹泻,给养猪业带来重大的经济损失。S蛋白作为PEDV最主要的膜蛋白,已有报道证实S蛋白含有病毒感染细胞的抗原表位区,但关于S蛋白介导PEDV进入细胞还有待于进一步研究,故本主要通过构建PEDV S1的伪型病毒研究富含抗原表位区的S1蛋白在PEDV进入细胞中的作用。本研究中,首先,为有效的检测PEDV,利用Vero E6繁殖的PEDV做为抗原,制备PEDV全病毒多克隆抗体。利用ELISA和间接免疫荧光对抗体的效价和特异性进行检测,结果显示该多克隆抗体与PEDV有很好的特异性反应。其次,为研究PEDV的感染特性,摒弃非同源细胞系,对PEDV在猪小肠上皮细胞（IEC）上进行适应培养,通过在IEC细胞中盲传10代,对第10代病毒液进行检测。反转录PCR、间接免疫荧光和电镜检查均证PEDV能够感染IEC细胞系,并稳定传代,故最终确定1EC是PEDV的易感细胞系。再次,为研究PEDV S1蛋白功能,构建S1蛋白的真核表达质粒,建立稳定表达S1蛋白的BHK-21细胞系,命名为BHK-S1。反转录PCR和间接免疫荧光鉴定,成功构建...
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：47 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 PEDV的根源
1.2 PED流行病学
1.3 PEDV基因结构
1.4 PEDV主要结构蛋白功能
1.5 PEDV非结构蛋白功能
1.6 PEDV细胞表面受体研究进展
1.7 PEDV繁殖与装配
1.8 假病毒研究进展
1.9 研究目的及意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 毒株、细胞、工程菌以及质粒
2.1.2 实验动物
2.1.3 实验主要试剂
2.1.4 试剂配制
2.1.5 主要仪器设备
2.2 试验方法
2.2.1 PEDV全病毒多克隆抗体的制备
2.2.2 PEDV全病毒多抗的生物活性及效价检测
2.2.3 PEDV感染靶细胞猪小肠上皮细胞(IEC)
2.2.4 PEDV S1真核表达载体的构建
2.2.5 PEDV伪型病毒VSVAG*PEDV S1的构建
2.2.6 利用PEDV伪型病毒对被感染IEC细胞中S1蛋白的定位研究
3 实验结果
3.1 PEDV多克隆抗体制备
3.1.1 PEDV繁殖培养
3.1.2 PEDV梯度密度离心
3.2 PEDV全病毒多抗的生物活性及效价检测
3.2.1 间接ELISA检测
3.2.2 间接免疫荧光检测
3.3 PEDV感染靶细胞IEC
3.3.1 反转录PCR检测
3.3.2 间接免疫荧光检测
3.3.3 电镜检测
3.4 PEDV S1真核表达载体的构建
3.4.1 酶切获取PEDV S1片段
3.4.2 鉴定pcDNA3.1-PEDV S1
3.5 PEDV伪型病毒VSVΔG~*PEDV S1的构建
3.5.1 稳定表达S1细胞系的建立
3.5.2 PEDV伪型病毒VSVΔG~*S1的鉴定
3.6 利用PEDV伪型病毒对被感染IEC细胞中S1蛋白的定位研究
4 讨论
4.1 PEDV全病毒多克隆抗体的制备
4.2 PEDV感染IEC细胞的研究
4.3 PEDV S1蛋白指导PEDV伪型病毒进入细胞
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻的流行特点及其防治措施[J]. 林忠武. 福建畜牧兽医. 2011(04)
[2]猪流行性腹泻流行特点及流行现状的研究[J]. 甘振磊,汤德元,李春燕,王彬,张晓杰,王凤,刘志杰. 猪业科学. 2010(12)
[3]猪传染性胃肠炎病毒n基因的原核表达及重组蛋白的免疫活性分析[J]. 孙东波,冯力,刘杰,时洪艳,佟有恩,刘胜旺,童光志. 病毒学报. 2006(02)
[4]猪流行性腹泻微量血清中和试验的建立和应用[J]. 林志雄,季树根,李力复,陈茹,童昆周. 中国兽医科技. 1994(11)
博士论文
[1]猪流行性腹泻病毒全基因组序列分析及感染性cDNA克隆的构建[D]. 陈建飞.中国农业科学院 2012
硕士论文
[1]猪流行性腹泻病毒S1蛋白亲和肽的筛选与鉴定[D]. 杨巍.东北农业大学 2011
[2]猪病毒性腹泻多重RT-PCR诊断方法的建立和应用及猪轮状病毒的分离[D]. 张坤.华中农业大学 2010
[3]猪流行性腹泻病毒S蛋白基因在昆虫细胞中的表达及间接ELISA抗体检测方法的初步建立[D]. 熊静.南京农业大学 2008
本文编号：3215964
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：47 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 PEDV的根源
1.2 PED流行病学
1.3 PEDV基因结构
1.4 PEDV主要结构蛋白功能
1.5 PEDV非结构蛋白功能
1.6 PEDV细胞表面受体研究进展
1.7 PEDV繁殖与装配
1.8 假病毒研究进展
1.9 研究目的及意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 毒株、细胞、工程菌以及质粒
2.1.2 实验动物
2.1.3 实验主要试剂
2.1.4 试剂配制
2.1.5 主要仪器设备
2.2 试验方法
2.2.1 PEDV全病毒多克隆抗体的制备
2.2.2 PEDV全病毒多抗的生物活性及效价检测
2.2.3 PEDV感染靶细胞猪小肠上皮细胞(IEC)
2.2.4 PEDV S1真核表达载体的构建
2.2.5 PEDV伪型病毒VSVAG*PEDV S1的构建
2.2.6 利用PEDV伪型病毒对被感染IEC细胞中S1蛋白的定位研究
3 实验结果
3.1 PEDV多克隆抗体制备
3.1.1 PEDV繁殖培养
3.1.2 PEDV梯度密度离心
3.2 PEDV全病毒多抗的生物活性及效价检测
3.2.1 间接ELISA检测
3.2.2 间接免疫荧光检测
3.3 PEDV感染靶细胞IEC
3.3.1 反转录PCR检测
3.3.2 间接免疫荧光检测
3.3.3 电镜检测
3.4 PEDV S1真核表达载体的构建
3.4.1 酶切获取PEDV S1片段
3.4.2 鉴定pcDNA3.1-PEDV S1
3.5 PEDV伪型病毒VSVΔG~*PEDV S1的构建
3.5.1 稳定表达S1细胞系的建立
3.5.2 PEDV伪型病毒VSVΔG~*S1的鉴定
3.6 利用PEDV伪型病毒对被感染IEC细胞中S1蛋白的定位研究
4 讨论
4.1 PEDV全病毒多克隆抗体的制备
4.2 PEDV感染IEC细胞的研究
4.3 PEDV S1蛋白指导PEDV伪型病毒进入细胞
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻的流行特点及其防治措施[J]. 林忠武. 福建畜牧兽医. 2011(04)
[2]猪流行性腹泻流行特点及流行现状的研究[J]. 甘振磊,汤德元,李春燕,王彬,张晓杰,王凤,刘志杰. 猪业科学. 2010(12)
[3]猪传染性胃肠炎病毒n基因的原核表达及重组蛋白的免疫活性分析[J]. 孙东波,冯力,刘杰,时洪艳,佟有恩,刘胜旺,童光志. 病毒学报. 2006(02)
[4]猪流行性腹泻微量血清中和试验的建立和应用[J]. 林志雄,季树根,李力复,陈茹,童昆周. 中国兽医科技. 1994(11)
博士论文
[1]猪流行性腹泻病毒全基因组序列分析及感染性cDNA克隆的构建[D]. 陈建飞.中国农业科学院 2012
硕士论文
[1]猪流行性腹泻病毒S1蛋白亲和肽的筛选与鉴定[D]. 杨巍.东北农业大学 2011
[2]猪病毒性腹泻多重RT-PCR诊断方法的建立和应用及猪轮状病毒的分离[D]. 张坤.华中农业大学 2010
[3]猪流行性腹泻病毒S蛋白基因在昆虫细胞中的表达及间接ELISA抗体检测方法的初步建立[D]. 熊静.南京农业大学 2008
本文编号：3215964
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