水貂阿留申病毒流行病学调查及感染性克隆的构建
发布时间：2021-06-07 06:06
水貂阿留申病（Aleutian Mink Disease,AD）又称水貂浆细胞增多症（Plasmacytosis）是由水貂阿留申病毒（Aleutian Mink Disease Virus,AMDV）感染引起水貂自身免疫系统功能紊乱的慢性、传染性疾病。该病的典型特征为渐进性消瘦、繁殖力下降、血清γ球蛋白增多、脾脏肿大、肾脏改变（从肿胀和瘀点到萎缩和凹陷）和肠系膜淋巴结肿大。AMDV可通过水平和垂直方式传播,引起母貂自然流产和仔貂死亡,能明显影响水貂繁殖性能和毛皮质量,AD是影响水貂养殖业的三大疫病之一。目前仍没有可用于预防的疫苗,也无可以彻底根治的治疗方案,只有通过定期的检疫、淘汰,达到逐步净化貂群的目的。因此,探索建立灵敏、高效、准确的诊断方法,开展流行病学调查以及针对AMDV开展分子生物学研究是非常必要的。本研究根据AMDV的VP2基因的保守区域设计一对特异性引物和探针,建立荧光定量PCR检测方法,标准曲线在1.0×102拷贝/μL至1.0×108拷贝/μL之间具有良好的线性关系,相关系数（r2）大于0.994,该方法检测的灵敏度为102拷贝/μL,且与犬细小病毒、犬腺病毒、犬瘟热...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
AMDV基因组结构示意图
中国农业科学院硕士学位论文第二章AMDVVP2基因TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用10表2-1引物和探针的序列Table2-1Thesequencesofprimersandprobe引物Primers引物序列(5’-3’)Primersequences(5"to3")片段大小ProductLength/bp退火温度AnnealingTemperature/℃AMDV-qPCR-FCGTTACAGGTTGCTTTAGATACTATTGGGTTGGTTTGGT10960AMDV-qPCR-RAMDV-qPCR-ProbeCCGTTGGGGGAAACACTGGGCT图2-1引物及探针设计示意图Fig.2-1Schematicdiagramofprimersandprobedesign2.2.2质粒标准品的制备利用拯救AMDV-G株病毒的全基因合成重组质粒作为标准品用于荧光定量PCR方法的建立，ADV-G株基因组GenBank号为M20036，病毒全基因亚克隆到pUC-19载体，命名为pUC-AMDV-G，由北京六合华大基因科技有限公司合成。提取质粒后，分光光度法测出其浓度，通过计算公式得出相应的拷贝数，作为后续实验的标准品，保存于-20℃。2.2.3荧光定量PCR反应条件的优化把将引物和探针稀释至10μM，反应共20μL的体系，在1μL探针条件下，进行TaqMan荧光定量PCR反应，依据Ct值及曲线形状不断优化上下游引物工作浓度。再以相同浓度重组质粒为模板，利用优化的上下游引物浓度，对探针加入量(0.2μL、0.4μL、0.8μL)进行优化，确定最佳探针工作浓度。2.2.4荧光定量PCR标准曲线的建立将标准品10倍稀释，以108为起始浓度，使用108至102拷贝/μL的质粒作为模板，并设置阴性对照，荧光定量PCR扩增使用3.2.3中优化的反应条件进行，这7个浓度各重复三次，获得动力学曲线，依据反应的Ct值及质粒的拷贝数建立标准曲线并获得对应的标准方程。
中国农业科学院硕士学位论文第二章AMDVVP2基因TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用12拷贝数计算公式：拷贝数(拷贝/μL)=(6.02×1023×稀释倍数×OD值×10-9)/(660×碱基数)，使用分光光度计测定质粒标准品OD值为：280ng/μL。代入公式可得出结果，标准品的拷贝数约为3.04×1010拷贝/μL。2.3.2荧光定量PCR反应条件的优化优化后的反应体系(20μL)中含有：试剂体积(μL)2×TransStartProbeqPCRSuperMix10Nuclease-freeWater7.8探针(10μM)0.4上下游引物(10μM)各0.4模板1优化后确定反应条件为：94℃30s；94℃5s，60℃30s，45个循环。2.3.3标准曲线的建立模板选用108~102拷贝/μL的标准品，每个浓度设置三个重复进行荧光定量PCR反应，得到相对应的扩增曲线，进行标准曲线的绘制，横纵坐标分别为各个浓度拷贝数的常用对数及其对应的Ct值，曲线方程为：Y=-3.456x+40.488，其相关系数（r2）为0.994（图2-2）。结果表明，在所选稀释度范围内，Ct值与拷贝数的常用对数表现出良好的线性关系。图2-2ADV荧光定量PCR标准曲线Fig.2-2ThestandardcurveofADVrealtimePCR2.3.4敏感性试验结果以10倍稀释的标准品为样品，选择范围为1.0×108拷贝/μL~1.0×101拷贝/μL，应用本研究建立荧光定量PCR方法测试其敏感性，以ddH2O为模板作为阴性对照，以Ct<35且出现标准的S
【参考文献】：
期刊论文
[1]水貂阿留申病诊断技术研究进展[J]. 韦韬,吴艳虹,丛丽,赵永强,马瑞芳,邵西群. 动物医学进展. 2019(06)
[2]水貂阿留申病的检疫方法[J]. 黄海娇. 畜牧兽医科技信息. 2018(11)
[3]水貂阿留申病诊断技术的进展[J]. 李俚,胡哲,孙金辉,关东嵩,方孟颀,王晓钧,路义鑫. 中国兽医杂志. 2018(11)
[4]小反刍兽疫病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 付明哲,杨峰,郝玉青,许信刚,张琪. 动物医学进展. 2018(11)
[5]复方中草药添加剂抗水貂阿留申病的研究[J]. 周贵凯,马泽芳,崔凯,李建栋. 黑龙江畜牧兽医. 2018(22)
[6]水貂阿留申病毒检测方法研究进展[J]. 刘艺,冷雪,时坤,李健明,曾范利,宗颖,宫庆龙,张姗姗,孙志博,刘亚东,杜锐. 动物医学进展. 2018(10)
[7]基于B细胞表位肽的水貂阿留申病毒抗体ELISA检测方法的建立及其在流行病学调查中的应用[J]. 孙殿钢,雷连成,黄盼盼,刘洪涛,杨柳枝,刘建方,冯新,孙长江. 中国预防兽医学报. 2018(06)
[8]两株水貂阿留申全基因重组核酸疫苗的免疫效果初步评估[J]. 孙利杰,刘东旭,李健明,冷雪,时坤,李东,杜锐. 中国兽药杂志. 2017(12)
[9]水貂阿留申病毒、肠炎病毒与犬瘟热病毒多重PCR检测方法的建立与应用[J]. 马芹,王元智,闫文卓,赵丽丽,陈洪岩,陆涛峰. 中国比较医学杂志. 2017(12)
[10]水貂阿留申病毒最新检测方法研究进展[J]. 庄金秋,梅建国,王玉茂,姚春阳,莫玲,沈志强. 现代畜牧兽医. 2017(11)
博士论文
[1]新型水貂阿留申病毒感染性克隆的构建及其生物学特性鉴定[D]. 郗冀.中国农业大学 2016
硕士论文
[1]水貂阿留申疾病的双重PCR检测方法建立及其应用[D]. 滕传杰.山东农业大学 2018
[2]水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用[D]. 王元智.中国农业科学院 2017
[3]水貂阿留申病毒VP2基因的原核表达及ELISA检测方法的建立[D]. 刘立兵.吉林农业大学 2013
本文编号：3216027
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
AMDV基因组结构示意图
中国农业科学院硕士学位论文第二章AMDVVP2基因TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用10表2-1引物和探针的序列Table2-1Thesequencesofprimersandprobe引物Primers引物序列(5’-3’)Primersequences(5"to3")片段大小ProductLength/bp退火温度AnnealingTemperature/℃AMDV-qPCR-FCGTTACAGGTTGCTTTAGATACTATTGGGTTGGTTTGGT10960AMDV-qPCR-RAMDV-qPCR-ProbeCCGTTGGGGGAAACACTGGGCT图2-1引物及探针设计示意图Fig.2-1Schematicdiagramofprimersandprobedesign2.2.2质粒标准品的制备利用拯救AMDV-G株病毒的全基因合成重组质粒作为标准品用于荧光定量PCR方法的建立，ADV-G株基因组GenBank号为M20036，病毒全基因亚克隆到pUC-19载体，命名为pUC-AMDV-G，由北京六合华大基因科技有限公司合成。提取质粒后，分光光度法测出其浓度，通过计算公式得出相应的拷贝数，作为后续实验的标准品，保存于-20℃。2.2.3荧光定量PCR反应条件的优化把将引物和探针稀释至10μM，反应共20μL的体系，在1μL探针条件下，进行TaqMan荧光定量PCR反应，依据Ct值及曲线形状不断优化上下游引物工作浓度。再以相同浓度重组质粒为模板，利用优化的上下游引物浓度，对探针加入量(0.2μL、0.4μL、0.8μL)进行优化，确定最佳探针工作浓度。2.2.4荧光定量PCR标准曲线的建立将标准品10倍稀释，以108为起始浓度，使用108至102拷贝/μL的质粒作为模板，并设置阴性对照，荧光定量PCR扩增使用3.2.3中优化的反应条件进行，这7个浓度各重复三次，获得动力学曲线，依据反应的Ct值及质粒的拷贝数建立标准曲线并获得对应的标准方程。
中国农业科学院硕士学位论文第二章AMDVVP2基因TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用12拷贝数计算公式：拷贝数(拷贝/μL)=(6.02×1023×稀释倍数×OD值×10-9)/(660×碱基数)，使用分光光度计测定质粒标准品OD值为：280ng/μL。代入公式可得出结果，标准品的拷贝数约为3.04×1010拷贝/μL。2.3.2荧光定量PCR反应条件的优化优化后的反应体系(20μL)中含有：试剂体积(μL)2×TransStartProbeqPCRSuperMix10Nuclease-freeWater7.8探针(10μM)0.4上下游引物(10μM)各0.4模板1优化后确定反应条件为：94℃30s；94℃5s，60℃30s，45个循环。2.3.3标准曲线的建立模板选用108~102拷贝/μL的标准品，每个浓度设置三个重复进行荧光定量PCR反应，得到相对应的扩增曲线，进行标准曲线的绘制，横纵坐标分别为各个浓度拷贝数的常用对数及其对应的Ct值，曲线方程为：Y=-3.456x+40.488，其相关系数（r2）为0.994（图2-2）。结果表明，在所选稀释度范围内，Ct值与拷贝数的常用对数表现出良好的线性关系。图2-2ADV荧光定量PCR标准曲线Fig.2-2ThestandardcurveofADVrealtimePCR2.3.4敏感性试验结果以10倍稀释的标准品为样品，选择范围为1.0×108拷贝/μL~1.0×101拷贝/μL，应用本研究建立荧光定量PCR方法测试其敏感性，以ddH2O为模板作为阴性对照，以Ct<35且出现标准的S
【参考文献】：
期刊论文
[1]水貂阿留申病诊断技术研究进展[J]. 韦韬,吴艳虹,丛丽,赵永强,马瑞芳,邵西群. 动物医学进展. 2019(06)
[2]水貂阿留申病的检疫方法[J]. 黄海娇. 畜牧兽医科技信息. 2018(11)
[3]水貂阿留申病诊断技术的进展[J]. 李俚,胡哲,孙金辉,关东嵩,方孟颀,王晓钧,路义鑫. 中国兽医杂志. 2018(11)
[4]小反刍兽疫病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 付明哲,杨峰,郝玉青,许信刚,张琪. 动物医学进展. 2018(11)
[5]复方中草药添加剂抗水貂阿留申病的研究[J]. 周贵凯,马泽芳,崔凯,李建栋. 黑龙江畜牧兽医. 2018(22)
[6]水貂阿留申病毒检测方法研究进展[J]. 刘艺,冷雪,时坤,李健明,曾范利,宗颖,宫庆龙,张姗姗,孙志博,刘亚东,杜锐. 动物医学进展. 2018(10)
[7]基于B细胞表位肽的水貂阿留申病毒抗体ELISA检测方法的建立及其在流行病学调查中的应用[J]. 孙殿钢,雷连成,黄盼盼,刘洪涛,杨柳枝,刘建方,冯新,孙长江. 中国预防兽医学报. 2018(06)
[8]两株水貂阿留申全基因重组核酸疫苗的免疫效果初步评估[J]. 孙利杰,刘东旭,李健明,冷雪,时坤,李东,杜锐. 中国兽药杂志. 2017(12)
[9]水貂阿留申病毒、肠炎病毒与犬瘟热病毒多重PCR检测方法的建立与应用[J]. 马芹,王元智,闫文卓,赵丽丽,陈洪岩,陆涛峰. 中国比较医学杂志. 2017(12)
[10]水貂阿留申病毒最新检测方法研究进展[J]. 庄金秋,梅建国,王玉茂,姚春阳,莫玲,沈志强. 现代畜牧兽医. 2017(11)
博士论文
[1]新型水貂阿留申病毒感染性克隆的构建及其生物学特性鉴定[D]. 郗冀.中国农业大学 2016
硕士论文
[1]水貂阿留申疾病的双重PCR检测方法建立及其应用[D]. 滕传杰.山东农业大学 2018
[2]水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用[D]. 王元智.中国农业科学院 2017
[3]水貂阿留申病毒VP2基因的原核表达及ELISA检测方法的建立[D]. 刘立兵.吉林农业大学 2013
本文编号：3216027
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