绵羊β-防御素（SBD-1）原核表达方法的建立
发布时间：2021-06-07 07:34
防御素是动物天然免疫中的重要组成部分,为一种抗菌肽。具有抗真菌、细菌以及抗病毒等作用。还具有杀死肿瘤细胞等生物学功能。相关研究已经比较深入。但防御素一直没有被广泛使用,原因在于大规模生产上存在困难。本实验通过两种方法体外表达绵羊防御素,并经过纯化,对其抗菌作用进行研究,为防御素应用研究和产业化提供实验依据,结果如下:方法一:与SUMO共同融合表达方法通过PCR扩增蒙古绵羊β防御素-1（SBD-1）基因,与SUMO基因连接后,构建获得pET-22b-SUMO-SBD-1重组质粒,将重组质粒转入BL21（DE3）细胞表达。分别通过超声破碎,脱盐,亲和层析,浓缩,SUMO酶切,冷冻干燥等技术处理后,获得绵羊β-防御素-1（SBD-1）。方法二:与类弹性蛋白ELP（Elastin-Like Protein,ELP）共同融合表达方法用PCR的方法克隆得到编码SBD-1的成熟肽全基因序列,ELP基因连接,克隆入原核表达载体pET-22b中,构建表达载体pET-22b-ELP-SBD-1,通过相关软件优化密码子,获得优化的ELP-SBD-1基因序列。以此序列为基础,合成该基因。将合成的优化的ELP-...
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同模型的抗菌肽作用机制/作用机理Fig1ariousmodelsmechanism/modeofactionofantimicrobialpeptides
图 2 β-防御素与菌体膜的相互作用Fig 2 β-defensin interaction with the cell membrane.2 抑制细胞壁的合成细胞壁是细菌的一个独特结构。由于真核动物细胞中没有细胞壁结构，所胞壁合成是抗菌肽的一个特殊特性。特别是脂质II，它是肽聚糖合成的重被证明是一种具有吸引力的抗菌化合物靶标。如I类细菌素，Nisin、Pacidin和Lcn972[18]。.3 抑制蛋白质，RNA和DNA合成一些AMPs可以进入细胞，而不破坏细胞膜，并靶向抑制细胞内的蛋白质成。一些类似于Buforin II的抗菌肽与DNA和RNA结合，可以阻止DNA和蛋成，并具有创伤修复、化疗吸引、血管生成等多密度的特性[18]。
结构作用没有研究清楚，但是通过深入研究得出高浓度的人β-防御素与CCL20的高亲合受体CCR6作用。对CCL20的分子结构分析得出，其分子结构与人的β-防御素相似程度非常高。1997年，Medzhitov等在Nature杂志报道Toll受体同源的Toll蛋白，对天然免疫和获得性免疫直接作用，此后他这种蛋白受到了大家的重视。而后在2002年发现大鼠β-防御素-2与Toll蛋白有同样可以促进单个核细胞NF- B活化的作用，促进IL-12及IFN-α炎症介质的分泌，促进分子CD80、CD86的表达，进而表现为促进单个核细胞的增殖。但是加入TLR4抗体之后已经活化的细胞数量都有不同程度的减少，说明β-防御素和Toll有同样的活性[27-31]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]SUMO蛋白酶Ulp1的高效表达纯化并通过His-SUMO标签制备scFv[J]. 李诗洁,杨艳坤,刘萌,白仲虎,金坚. 中国生物工程杂志. 2018(03)
[2]小分子泛素相关修饰物SUMO及其融合表达[J]. 陈相剑,项灵娇,严雪妮,林陈水. 氨基酸和生物资源. 2015(03)
[3]融合标签在蛋白质可溶性表达中的应用进展[J]. 吴珊珊,朱芸,陈珊珊,何冰芳. 化工进展. 2014(04)
[4]连接肽对融合蛋白ELP[I]30-linker-eGFP相变的影响[J]. 张立超,李军明,葛高顺,孔令岭,胡学军. 生命科学研究. 2013(05)
[5]ELP[Ⅰ]50标签在重组硫氧还蛋白分离纯化中的应用及PEG对其相变温度的影响[J]. 葛高顺,张立超,李军明,胡学军. 微生物学通报. 2013(06)
[6]重组蛋白在大肠杆菌分泌表达的研究进展[J]. 郑海洲,刘晓志,宋欣. 天津药学. 2009(04)
[7]利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究[J]. 姜媛媛,尹成凯,李晋南,任桂萍,张薇,李德山. 东北农业大学学报. 2008(10)
[8]纯化组氨酸标签蛋白金属螯合亲和色谱填料的制备与性能[J]. 孙永亮,李淑娟,胡道道,崔亚丽,陈超,杨菊香,沈淑坤. 陕西师范大学学报(自然科学版). 2007(02)
[9]趋化因子研究进展[J]. 刘相东,宿振国,周玉明,杨平玲,刘春. 滨州医学院学报. 1999(05)
博士论文
[1]组织蛋白酶D基因沉默诱导HeLa细胞老化的机制研究[D]. 苏思远.中国科学院北京基因组研究所 2016
[2]APRIL阻断剂BCMA-Fc的表达，纯化及活性研究[D]. 孟宪超.复旦大学 2013
[3]小泛素样修饰物介导的纯化技术研究及其应用[D]. 李俊华.江南大学 2013
[4]pH偏移处理诱导熔球态大豆蛋白的结构变化及功能性质的改善[D]. 蒋将.江南大学 2011
[5]蒙古绵羊β-防御素-1的表达、纯化及生物学功能研究[D]. 赵鹏伟.内蒙古农业大学 2011
[6]公共物品有效提供的经济学分析[D]. 吴伟.西北大学 2004
硕士论文
[1]硫磺菌蘑菇凝集素作为融合标签在蛋白质表达和纯化中的应用研究[D]. 李晓静.河南农业大学 2016
[2]实验室常用质粒对宿主大肠杆菌MG1655全菌蛋白表达谱影响的研究[D]. 崔勇.安徽大学 2014
[3]单链抗体融合蛋白ScFv-9R在大肠杆菌中的高效表达和介导siRNA靶向RT112细胞的研究[D]. 张喜光.吉林大学 2014
[4]ELP特性研究及ELP标签在重组蛋白纯化中的应用[D]. 袁君.郑州大学 2014
[5]蛋白质SUMO化修饰的原核表达系统构建[D]. 唐波.西北农林科技大学 2013
[6]可溶性人SUMO融合表达系统的研究[D]. 王中原.吉林大学 2010
[7]超酸性蛋白融合标签对大肠杆菌中重组蛋白可溶性表达的作用研究[D]. 曹丽娟.华东师范大学 2008
本文编号：3216158
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同模型的抗菌肽作用机制/作用机理Fig1ariousmodelsmechanism/modeofactionofantimicrobialpeptides
图 2 β-防御素与菌体膜的相互作用Fig 2 β-defensin interaction with the cell membrane.2 抑制细胞壁的合成细胞壁是细菌的一个独特结构。由于真核动物细胞中没有细胞壁结构，所胞壁合成是抗菌肽的一个特殊特性。特别是脂质II，它是肽聚糖合成的重被证明是一种具有吸引力的抗菌化合物靶标。如I类细菌素，Nisin、Pacidin和Lcn972[18]。.3 抑制蛋白质，RNA和DNA合成一些AMPs可以进入细胞，而不破坏细胞膜，并靶向抑制细胞内的蛋白质成。一些类似于Buforin II的抗菌肽与DNA和RNA结合，可以阻止DNA和蛋成，并具有创伤修复、化疗吸引、血管生成等多密度的特性[18]。
结构作用没有研究清楚，但是通过深入研究得出高浓度的人β-防御素与CCL20的高亲合受体CCR6作用。对CCL20的分子结构分析得出，其分子结构与人的β-防御素相似程度非常高。1997年，Medzhitov等在Nature杂志报道Toll受体同源的Toll蛋白，对天然免疫和获得性免疫直接作用，此后他这种蛋白受到了大家的重视。而后在2002年发现大鼠β-防御素-2与Toll蛋白有同样可以促进单个核细胞NF- B活化的作用，促进IL-12及IFN-α炎症介质的分泌，促进分子CD80、CD86的表达，进而表现为促进单个核细胞的增殖。但是加入TLR4抗体之后已经活化的细胞数量都有不同程度的减少，说明β-防御素和Toll有同样的活性[27-31]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]SUMO蛋白酶Ulp1的高效表达纯化并通过His-SUMO标签制备scFv[J]. 李诗洁,杨艳坤,刘萌,白仲虎,金坚. 中国生物工程杂志. 2018(03)
[2]小分子泛素相关修饰物SUMO及其融合表达[J]. 陈相剑,项灵娇,严雪妮,林陈水. 氨基酸和生物资源. 2015(03)
[3]融合标签在蛋白质可溶性表达中的应用进展[J]. 吴珊珊,朱芸,陈珊珊,何冰芳. 化工进展. 2014(04)
[4]连接肽对融合蛋白ELP[I]30-linker-eGFP相变的影响[J]. 张立超,李军明,葛高顺,孔令岭,胡学军. 生命科学研究. 2013(05)
[5]ELP[Ⅰ]50标签在重组硫氧还蛋白分离纯化中的应用及PEG对其相变温度的影响[J]. 葛高顺,张立超,李军明,胡学军. 微生物学通报. 2013(06)
[6]重组蛋白在大肠杆菌分泌表达的研究进展[J]. 郑海洲,刘晓志,宋欣. 天津药学. 2009(04)
[7]利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究[J]. 姜媛媛,尹成凯,李晋南,任桂萍,张薇,李德山. 东北农业大学学报. 2008(10)
[8]纯化组氨酸标签蛋白金属螯合亲和色谱填料的制备与性能[J]. 孙永亮,李淑娟,胡道道,崔亚丽,陈超,杨菊香,沈淑坤. 陕西师范大学学报(自然科学版). 2007(02)
[9]趋化因子研究进展[J]. 刘相东,宿振国,周玉明,杨平玲,刘春. 滨州医学院学报. 1999(05)
博士论文
[1]组织蛋白酶D基因沉默诱导HeLa细胞老化的机制研究[D]. 苏思远.中国科学院北京基因组研究所 2016
[2]APRIL阻断剂BCMA-Fc的表达，纯化及活性研究[D]. 孟宪超.复旦大学 2013
[3]小泛素样修饰物介导的纯化技术研究及其应用[D]. 李俊华.江南大学 2013
[4]pH偏移处理诱导熔球态大豆蛋白的结构变化及功能性质的改善[D]. 蒋将.江南大学 2011
[5]蒙古绵羊β-防御素-1的表达、纯化及生物学功能研究[D]. 赵鹏伟.内蒙古农业大学 2011
[6]公共物品有效提供的经济学分析[D]. 吴伟.西北大学 2004
硕士论文
[1]硫磺菌蘑菇凝集素作为融合标签在蛋白质表达和纯化中的应用研究[D]. 李晓静.河南农业大学 2016
[2]实验室常用质粒对宿主大肠杆菌MG1655全菌蛋白表达谱影响的研究[D]. 崔勇.安徽大学 2014
[3]单链抗体融合蛋白ScFv-9R在大肠杆菌中的高效表达和介导siRNA靶向RT112细胞的研究[D]. 张喜光.吉林大学 2014
[4]ELP特性研究及ELP标签在重组蛋白纯化中的应用[D]. 袁君.郑州大学 2014
[5]蛋白质SUMO化修饰的原核表达系统构建[D]. 唐波.西北农林科技大学 2013
[6]可溶性人SUMO融合表达系统的研究[D]. 王中原.吉林大学 2010
[7]超酸性蛋白融合标签对大肠杆菌中重组蛋白可溶性表达的作用研究[D]. 曹丽娟.华东师范大学 2008
本文编号：3216158
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