基于iTRAO技术的传染性法氏囊病病毒感染DF-1细胞的亚细胞蛋白组分析
发布时间：2021-06-07 15:24
传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus, IBDV）属于双RNA病毒科,禽双RNA病毒属。它主要侵害3-12周龄的雏鸡和青年鸡,破坏法氏囊中淋巴滤泡未成熟的B细胞,导致免疫抑制,使得感染鸡常常发生免疫失败并且会增加对其他病原的易感性。由于其病毒基因组较小,编码蛋白少,常被作为dsRNA的模式病毒进行深入研究。IBDV基因组为A和B两个节段组成,分别编码RNA依赖的RNA聚合酶VP1、衣壳蛋白VP2与VP3、病毒自身的蛋白酶VP4和非结构蛋白VP5共五种蛋白。目前对于该病毒与宿主细胞相互作用的机制认识还相对有限,致病机制尚且不明。本研究以IBDV感染鸡胚成纤维细胞DF-1为模型,应用亚细胞蛋白组学结合定量蛋白质组学技术—相对和绝对定量的等量异位标签（iTRAQ）对IBDV感染细胞的蛋白表达变化进行探索。为了探索病毒与宿主细胞的相互作用,本研究以DF-1细胞为IBDV感染模型,采用iTRAQ新技术结合LC-MS/MS质谱鉴定的研究方法,分析细胞感染病毒后24小时的细胞质、细胞核两组亚细胞蛋白质组表达变化动态。LC-MS/MS质谱分析结果表明,胞质...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：130 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
论文创新点
摘要
Abstract
研究意义
技术路线
第一部分 文献综述
第一章 鸡传染性法氏囊病病毒的研究进展
1 IBDV的基因组结构和编码蛋白
1.1 VP1蛋白
1.2 VP2蛋白
1.3 VP3蛋白
1.4 VP4蛋白
1.5 VP5蛋白
1.6 5’-NCR和3’-NCR
2 病毒形态结构、复制和繁殖
2.1 病毒的形态和结构
2.2 IBDV的复制和繁殖
3 IBDV的致病性与免疫抑制
3.1 IBDV的致病性
3.2 IBDV引起的免疫抑制
4 IBDV与宿主的相互作用研究
第二章 定量蛋白质组学及其在病毒学研究中的应用
1 蛋白质组学研究技术
1.1 定量蛋白质组学
1.1.1 荧光差异双向电泳技术--DIGE
1.1.2 细胞培养稳定同位素标记技术--SILAC
1.1.3 同位素亲和标签技术--ICAT
1.1.4 同位素标记相对和绝对定量技术--iTRAQ
2 亚细胞蛋白质组学
2.1 细胞核蛋白质组学
2.1.1 核膜蛋白质组学
2.1.2 核仁蛋白质组学
2.1.3 核孔复合物蛋白质组
2.2 线粒体蛋白质组学
2.3 细胞骨架蛋白质组学
2.4 膜蛋白质组学
2.5 其他细胞器蛋白质组学
2.5.1 高尔基体蛋白质组学
2.5.2 内质网蛋白质组学
2.5.3 过氧化物酶体和溶酶体蛋白质组学
第三章 Rho GTPases蛋白研究进展
1 Rho GTPases
1.1 Rho GEFs
1.2 Rho GAPs
1.3 Rho GDIs
2 Rho GTPases的信号途径
2.1 Rho GTPases的上游信号途径
2.2 Rho GTPases的下游信号途径
2.2.1 PAKs(p21-activated kinase)
2.2.2 Rho连接激酶(Rho associated coiled-coiled kinase,ROCK)
2.2.3 IQGApl(IQ motif containing GTPase-activating protein 1)
3 Rho GTPases与细胞骨架
第二部分 研究内容
第一章 基于ITRAQ技术的传染性法氏囊病病毒感染DF-1细胞的亚细胞蛋白组分析
摘要
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 毒株与细胞
1.1.2 试剂与药品
1.1.3 抗体
1.1.4 仪器和软件
1.2 实验方法
1.2.1 样品制备
1.2.1.1 样品准备
1.2.1.2 流式细胞仪对样品感染率的检测
1.2.1.3 预实验SDS-PAGE电泳
1.2.2 酶解和肽段定量
1.2.3 肽段标记
1.2.4 毛细管高效液相色谱
1.2.5 质谱鉴定
1.2.6 数据分析
1.2.6.1 原始质谱数据及Maxquant数据库搜索
1.2.6.2 定量分析
1.2.7 生物信息学分析
1.2.7.1 层次聚类分析
1.2.7.2 差异蛋白的功能分类
1.2.7.3 构建差异蛋白互作网络分析
1.2.8 引物设计
1.2.9 Western blot验证
1.2.10 免疫荧光(IFA)验证
2 结果
2.1 样品制备
2.2 预实验SDS-PAGE电泳
2.3 酶解肽段浓度测定
2.4 蛋白质鉴定结果
2.5 差异表达蛋白的功能分类
2.6 差异表达蛋白的转录本分析
2.7 差异表达蛋白的IPA分析
2.8 差异表达蛋白的免疫荧光验证
2.9 差异表达蛋白的Western blot鉴定
3 讨论
3.1 病毒感染与干扰素诱导效应蛋白
3.2 病毒感染与RNA加工、凋亡相关蛋白
第二章 RhoGDI及其相关信号通路蛋白在鸡传染性法氏囊病病毒感染中的功能分析
搞要
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 病毒,细胞、载体和抗体
1.1.2 试剂、材料和仪器
1.2 实验方法
1.2.1 感染样品的制备
1.2.2 总RNA抽提
1.2.3 反转录
1.2.4 Real-time PCR与数据分析
1.2.5 Western blot验证
1.2.6 脂质体介导的细胞转染
1.2.7 免疫荧光(IFA)验证
1.2.8 免疫共沉淀分析
1.2.9 RhoGDI的过表达
1.2.10 病毒滴度测定
2 结果
2.1 IBDV感染对宿主DF-1细胞RhoGDI及相关信号通路基因转录水平的影响
2.2 IBDV感染对宿主DF-1细胞RhoGDI蛋白水平的检测
2.3 真核过表达RhoGDI对病毒的主要编码基因的转录水平的影响
2.4 真核过表达RhoGDI对病毒的主要编码蛋白表达水平的影响
2.5 真核过表达RhoGDI对IBDV病毒滴度的影响
2.6 真核过表达病毒编码蛋白VP3对RhoGDI转录水平的影响
2.7 真核过表达病毒编码蛋白VP3对RhoGDI的蛋白表达水平的影响
2.8 IBDV编码蛋白VP3与RhoGDI效应蛋白RhoA的相互作用分析
3 讨论
总结与展望
参考文献
第三部分 附录
附录A 缩略词
附录B 常用缓冲液及培养基配方
附录C 攻读博士期间录用或待发表的学术论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]应用蛋白质组学技术筛选胰腺癌生物标志物的研究进展[J]. 刘辉,张海婧,陈国强,吕丽艳,李智立. 世界华人消化杂志. 2007(14)
[2]传染性法氏囊病毒的抗原及分子特征(英文)[J]. 周继勇,叶菊秀,叶伟成,陈庆新,郑肖娟,郭军庆. 生物化学与生物物理进展. 2005(01)
博士论文
[1]传染性法氏囊病病毒VP4蛋白磷酸化修饰的研究[D]. 王三应.浙江大学 2013
[2]狂犬病毒感染的神经细胞差异蛋白质组学研究及伴侣素CCTγ的功能分析[D]. 张金阳.浙江大学 2012
[3]传染性法氏囊病毒感染鸡靶器官的比较蛋白质组研究[D]. 吴永平.浙江大学 2009
[4]传染性法氏囊病毒感染的生物标记与细胞SAGE文库的鉴定[D]. 王永志.浙江大学 2009
[5]猪圆环病毒2型感染PK-15细胞差异蛋白质组研究[D]. 张鑫.浙江大学 2009
[6]传染性法氏囊病病毒感染细胞的差异蛋白质组学研究[D]. 郑肖娟.浙江大学 2007
[7]传染性法氏囊病毒粒子感染及其A节段编码基因转化细胞的转录本初步分析[D]. 叶菊秀.浙江大学 2006
本文编号：3216830
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：130 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
论文创新点
摘要
Abstract
研究意义
技术路线
第一部分 文献综述
第一章 鸡传染性法氏囊病病毒的研究进展
1 IBDV的基因组结构和编码蛋白
1.1 VP1蛋白
1.2 VP2蛋白
1.3 VP3蛋白
1.4 VP4蛋白
1.5 VP5蛋白
1.6 5’-NCR和3’-NCR
2 病毒形态结构、复制和繁殖
2.1 病毒的形态和结构
2.2 IBDV的复制和繁殖
3 IBDV的致病性与免疫抑制
3.1 IBDV的致病性
3.2 IBDV引起的免疫抑制
4 IBDV与宿主的相互作用研究
第二章 定量蛋白质组学及其在病毒学研究中的应用
1 蛋白质组学研究技术
1.1 定量蛋白质组学
1.1.1 荧光差异双向电泳技术--DIGE
1.1.2 细胞培养稳定同位素标记技术--SILAC
1.1.3 同位素亲和标签技术--ICAT
1.1.4 同位素标记相对和绝对定量技术--iTRAQ
2 亚细胞蛋白质组学
2.1 细胞核蛋白质组学
2.1.1 核膜蛋白质组学
2.1.2 核仁蛋白质组学
2.1.3 核孔复合物蛋白质组
2.2 线粒体蛋白质组学
2.3 细胞骨架蛋白质组学
2.4 膜蛋白质组学
2.5 其他细胞器蛋白质组学
2.5.1 高尔基体蛋白质组学
2.5.2 内质网蛋白质组学
2.5.3 过氧化物酶体和溶酶体蛋白质组学
第三章 Rho GTPases蛋白研究进展
1 Rho GTPases
1.1 Rho GEFs
1.2 Rho GAPs
1.3 Rho GDIs
2 Rho GTPases的信号途径
2.1 Rho GTPases的上游信号途径
2.2 Rho GTPases的下游信号途径
2.2.1 PAKs(p21-activated kinase)
2.2.2 Rho连接激酶(Rho associated coiled-coiled kinase,ROCK)
2.2.3 IQGApl(IQ motif containing GTPase-activating protein 1)
3 Rho GTPases与细胞骨架
第二部分 研究内容
第一章 基于ITRAQ技术的传染性法氏囊病病毒感染DF-1细胞的亚细胞蛋白组分析
摘要
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 毒株与细胞
1.1.2 试剂与药品
1.1.3 抗体
1.1.4 仪器和软件
1.2 实验方法
1.2.1 样品制备
1.2.1.1 样品准备
1.2.1.2 流式细胞仪对样品感染率的检测
1.2.1.3 预实验SDS-PAGE电泳
1.2.2 酶解和肽段定量
1.2.3 肽段标记
1.2.4 毛细管高效液相色谱
1.2.5 质谱鉴定
1.2.6 数据分析
1.2.6.1 原始质谱数据及Maxquant数据库搜索
1.2.6.2 定量分析
1.2.7 生物信息学分析
1.2.7.1 层次聚类分析
1.2.7.2 差异蛋白的功能分类
1.2.7.3 构建差异蛋白互作网络分析
1.2.8 引物设计
1.2.9 Western blot验证
1.2.10 免疫荧光(IFA)验证
2 结果
2.1 样品制备
2.2 预实验SDS-PAGE电泳
2.3 酶解肽段浓度测定
2.4 蛋白质鉴定结果
2.5 差异表达蛋白的功能分类
2.6 差异表达蛋白的转录本分析
2.7 差异表达蛋白的IPA分析
2.8 差异表达蛋白的免疫荧光验证
2.9 差异表达蛋白的Western blot鉴定
3 讨论
3.1 病毒感染与干扰素诱导效应蛋白
3.2 病毒感染与RNA加工、凋亡相关蛋白
第二章 RhoGDI及其相关信号通路蛋白在鸡传染性法氏囊病病毒感染中的功能分析
搞要
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 病毒,细胞、载体和抗体
1.1.2 试剂、材料和仪器
1.2 实验方法
1.2.1 感染样品的制备
1.2.2 总RNA抽提
1.2.3 反转录
1.2.4 Real-time PCR与数据分析
1.2.5 Western blot验证
1.2.6 脂质体介导的细胞转染
1.2.7 免疫荧光(IFA)验证
1.2.8 免疫共沉淀分析
1.2.9 RhoGDI的过表达
1.2.10 病毒滴度测定
2 结果
2.1 IBDV感染对宿主DF-1细胞RhoGDI及相关信号通路基因转录水平的影响
2.2 IBDV感染对宿主DF-1细胞RhoGDI蛋白水平的检测
2.3 真核过表达RhoGDI对病毒的主要编码基因的转录水平的影响
2.4 真核过表达RhoGDI对病毒的主要编码蛋白表达水平的影响
2.5 真核过表达RhoGDI对IBDV病毒滴度的影响
2.6 真核过表达病毒编码蛋白VP3对RhoGDI转录水平的影响
2.7 真核过表达病毒编码蛋白VP3对RhoGDI的蛋白表达水平的影响
2.8 IBDV编码蛋白VP3与RhoGDI效应蛋白RhoA的相互作用分析
3 讨论
总结与展望
参考文献
第三部分 附录
附录A 缩略词
附录B 常用缓冲液及培养基配方
附录C 攻读博士期间录用或待发表的学术论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]应用蛋白质组学技术筛选胰腺癌生物标志物的研究进展[J]. 刘辉,张海婧,陈国强,吕丽艳,李智立. 世界华人消化杂志. 2007(14)
[2]传染性法氏囊病毒的抗原及分子特征(英文)[J]. 周继勇,叶菊秀,叶伟成,陈庆新,郑肖娟,郭军庆. 生物化学与生物物理进展. 2005(01)
博士论文
[1]传染性法氏囊病病毒VP4蛋白磷酸化修饰的研究[D]. 王三应.浙江大学 2013
[2]狂犬病毒感染的神经细胞差异蛋白质组学研究及伴侣素CCTγ的功能分析[D]. 张金阳.浙江大学 2012
[3]传染性法氏囊病毒感染鸡靶器官的比较蛋白质组研究[D]. 吴永平.浙江大学 2009
[4]传染性法氏囊病毒感染的生物标记与细胞SAGE文库的鉴定[D]. 王永志.浙江大学 2009
[5]猪圆环病毒2型感染PK-15细胞差异蛋白质组研究[D]. 张鑫.浙江大学 2009
[6]传染性法氏囊病病毒感染细胞的差异蛋白质组学研究[D]. 郑肖娟.浙江大学 2007
[7]传染性法氏囊病毒粒子感染及其A节段编码基因转化细胞的转录本初步分析[D]. 叶菊秀.浙江大学 2006
本文编号：3216830
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