绵羊PHD2基因克

发布时间：2017-04-23 05:12

  本文关键词：绵羊PHD2基因克隆、表达及变异分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本试验以甘肃高山细毛羊、藏绵羊、滩羊、塔什库尔干羊、哈萨克羊和湖羊共6个绵羊群体为研究对象,克隆测定藏绵羊PHD2基因CDS序列并对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR技术检测PHD2基因mRNA在绵羊十二指肠等13个组织中的相对表达量。运用PCR-SSCP技术分析6个绵羊群体中PHD2基因的遗传多态性,以探讨藏绵羊PHD2基因遗传特异性,丰富藏绵羊高原低氧适应候选基因的研究基础数据。主要研究结果及结论如下:(1)本试验经克隆测序获得藏绵羊PHD2基因CDS序列,序列长2609bp,编码358个氨基酸残基;与Ensemble数据库中绵羊序列比对发现2个SNPs,均为同义突变。蛋白分子式为C1691H2674N496O514S12,分子量为38561.5,理论等电点(PI)为8.64。该蛋白由线粒体合成,为亲水性蛋白和稳定蛋白。预测分析发现藏绵羊PHD2蛋白无信号肽剪切位点和跨膜螺旋结构,存在两个低复杂度区域和三个结构域。该蛋白翻译后修饰的主要方式是磷酸化,在细胞内主要行翻译、氨基酸生物合成、中央中介代谢、调节功能、复制和转录和脂肪酸代谢作用,且以连接酶的形式在细胞内发挥底物合成等酶生物学作用。蛋白二级结以无规卷曲为主,三级结构主要由β折叠和无规卷曲缠绕折叠形成。(2)PHD2基因在绵羊各组织部位中均有表达,但其表达存在组织差异性。其中在十二指肠中表达量最高,大脑和脾脏中该基因中度表达,在其他组织中中度或微量表达。(3)绵羊PHD2基因多态性丰富、遗传变异程度高。在内含子6-外显子7区发现5处核苷酸突变。6个绵羊群体PHD2基因检测到AD、AB、BC、BD共4种基因型,由A、B、C、D四个等位基因调控。序列比对可知,等位基因A序列与GenBank中公布的绵羊PHD2基因原序列无差异;等位基因B序列相较于原序列,在105处插入碱基A;等位基因C序列较原序列,在105处插入碱基A,存在c.278 TC颠换,等位基因D序列较原序列,存在c.188TC颠换、c.286AG颠换和c.290CA颠换;因为扩增序列为内含子序列,因此不造成氨基酸的改变。
【关键词】：藏绵羊 PHD2基因 PCR-SSCP 克隆 基因表达
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S826
【目录】：

• 摘要4-5
• Summary5-9
• 第一章 文献综述9-22
• 1 高原低氧适应性进化9-15
• 1.1 生理生化、形态结构和细胞代谢等的适应性进化特征9-10
• 1.2 分子水平适应进化10-15
• 2 脯氨酸羟化酶概述15-18
• 2.1 PHDs家族概述15-16
• 2.2 PHDs的类型和分布16
• 2.3 染色体定位及基因结构16
• 2.4 PHDs家族的工作机制16-17
• 2.5 PHDs家族的生物学功能17-18
• 3 PHD2基因及其研究进展18-20
• 3.1 PHD2基因的结构特点及表达调控18
• 3.2 PHD2基因多态性和表达研究18-20
• 3.3 PHD2基因在高原低氧适应中的研究进展20
• 4 本研究的目的和意义20-22
• 第二章 试验材料与研究方法22-39
• 1 试验材料22-26
• 1.1 血样、组织样采集22
• 1.2 主要试剂、仪器设备和主要溶剂配制22-26
• 2 试验方法26-36
• 2.1 DNA的提取和检测26-27
• 2.2 总RNA的提取和检测27-29
• 2.3 cDNA合成29-30
• 2.4 引物设计与扩增30-32
• 2.5 扩增产物琼脂糖检测32-33
• 2.6 扩增产物SSCP检测33-34
• 2.7 基因克隆与测序34-36
• 3 数据分析方法36-39
• 3.1 生物信息学分析方法36
• 3.2 实时荧光定量数据分析方法36-37
• 3.3 基因多态性分析方法37-39
• 第三章 结果与分析39-56
• 1 藏绵羊PHD2基因生物信息学分析39-49
• 1.1 藏绵羊PHD2基因PCR扩增结果39
• 1.2 藏绵羊扩增序列比对39-40
• 1.3 藏绵羊PHD2蛋白理化性质分析40-41
• 1.4 亚细胞定位41
• 1.5 信号肽剪切位点预测41-42
• 1.6 跨膜螺旋结构预测42-43
• 1.7 磷酸化和糖基化位点预测43
• 1.8 保守结构域分析43-44
• 1.9 亲疏水性分析44-45
• 1.10 功能预测与分析45-47
• 1.11 二级结构和三级结构预测分析47-49
• 2 绵羊PHD2基因各组织表达差异49-52
• 2.1 总RNA提取琼脂糖电泳质量检测49
• 2.2 目的基因PCR产物琼脂糖电泳检测49-50
• 2.3 目的基因RT-qPCR动力学曲线分析50-51
• 2.4 目的基因RT-qPCR溶解曲线分析51
• 2.5 目的基因在绵羊不同组织中的表达分析51-52
• 3 绵羊PHD2基因多态性遗传特征52-56
• 3.1 PCR扩增检测52
• 3.2 SSCP检测52-53
• 3.3 等位基因序列比对53-54
• 3.4 群体遗传特性分析54-56
• 第四章 讨论56-59
• 1 藏绵羊PHD2基因生物信息学特征56-57
• 2 绵羊PHD2基因mRNA表达差异57
• 3 绵羊PHD2基因变异特征57-59
• 第五章 结论59-60
• 参考文献60-66
• 附件66-68
• 致谢68-69
• 作者简介69-70
• 导师简介70-71

【参考文献】

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本文编号：321887