早期妊娠对牛外周血单核细胞表达Th1、Th2免疫因子的影响

发布时间：2017-04-23 06:01

  本文关键词：早期妊娠对牛外周血单核细胞表达Th1、Th2免疫因子的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：外周血单个核细胞源于骨髓中的造血干细胞,主要包括淋巴细胞和单核细胞,经血液循环或淋巴循环到达组织或器官,作为一个整体参与机体的系统免疫。为探索妊娠早期牛外周血单个核细胞表达Th1型细胞因子和Th2型细胞因子的变化规律,本研究以12头健康的奶牛为研究对象,采用密度梯度离心的方法得到牛外周血单个核细胞,并运用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和细胞免疫化学等实验方法,研究了早期妊娠奶牛在外周血单个核细胞表达Th1和Th2免疫因子的变化。得到了如下结果:1、利用密度梯度离心的方法,成功从牛外周血中分离得到了单个核细胞。从分离的结果来看,细胞分层明显,由上层到下层依次为血浆,单个核细胞,粒细胞,红细胞。牛外周血单个核细胞为云雾状,利用此方法较易获取。2、利用实时荧光定量PCR法检测发现,妊娠早期牛外周血单个核细胞中的Th1型细胞因子中的IFN-γ表达量逐渐降低,但是TNF-α和IL-2的表达量逐渐升高。然而,在妊娠30d的牛外周血单个核细胞中的Th2型细胞因子,包括IL-4,IL-5,IL-6,IL-10和IL-13表达量逐渐升高。总之,妊娠早期牛外周血单个核细胞中Th2细胞因子表达量增加,这对牛妊娠成功是必不可少的。3、采用蛋白免疫印迹检测早期妊娠对牛外周血单个核细胞中的IFN-γ蛋白表达的影响,结果发现,未妊娠牛外周血单个核细胞中IFN-γ的表达量高于妊娠期牛外周血单个核细胞。可以发现,牛外周血单个核细胞IFN-γ表达量显著降低对牛早期妊娠十分关键。4、经免疫细胞化学染色证实,牛外周血单个核细胞在妊娠牛18d和妊娠牛30d,IFN-γ的表达水平显著减少,在未妊娠牛18d牛外周血单个核细胞观察到IFN-γ在牛外周血单个核细胞的细胞质免疫细胞化学染色较强,而且单核细胞免疫细胞化学染色强于淋巴细胞。
【关键词】：妊娠 外周血单个核细胞 细胞因子 实时荧光定量PCR 蛋白免疫印迹 免疫化学细胞
【学位授予单位】：河北工程大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 英文缩略表11-12
• 第一章 文献综述12-21
• 1.1 引言12
• 1.2 妊娠早期的胚胎识别和免疫耐受机制的研究进展12-16
• 1.2.1 反刍动物妊娠识别信号--IFN-tau12-13
• 1.2.2 IFN-tau的子宫外作用13
• 1.2.3 IFN-tau的抗黄体溶解机制13
• 1.2.4 孕酮在早期妊娠对机体的免疫耐受作用13-14
• 1.2.5 孕酮诱导阻断因子介导的妊娠免疫耐受14
• 1.2.6 PIBF与细胞因子结合参与免疫调节14
• 1.2.7 PIBF通过干扰素信号通路参与子宫内的免疫调节14-15
• 1.2.8 孕酮介导其它调节基因参与免疫15
• 1.2.9 胚胎免疫耐受机制的研究进展15-16
• 1.3 早期妊娠Th细胞及其细胞因子功能的研究进展16-18
• 1.3.1 Th1细胞因子与妊娠的研究进展16-17
• 1.3.2 Th2细胞因子与妊娠的研究进展17-18
• 1.4 牛妊娠引起的全身免疫调节机制18-19
• 1.5 本研究的技术路线和目的、意义19-21
• 1.5.1 本研究技术路线19
• 1.5.2 研究目的与意义19-21
• 第二章 牛外周血单个核细胞表达Th1、Th2免疫因子mRNA的分析21-32
• 2.1 试验材料与方法21-22
• 2.1.1 试验动物与分组21
• 2.1.2 主要仪器和设备21-22
• 2.1.3 主要试剂和耗材22
• 2.2 试验方法22
• 2.2.1 PBMCs所需主要溶液的配置22
• 2.3 样品采集与处理22-23
• 2.3.1 PBMCs的分离方法22-23
• 2.4 实时荧光定量PCR检测基因相对表达水平23-26
• 2.4.1 PBMCs的分离方法23-24
• 2.4.2 总RNA的提取和RNA浓度及纯度检测24-25
• 2.4.3 cDNA的合成25
• 2.4.4 实时荧光定量PCR25-26
• 2.4.5 PCR产物凝胶电泳26
• 2.5 数据分析26
• 2.6 结果与分析26-29
• 2.6.1 牛外周血单个核细胞分离结果26-27
• 2.6.2 总RNA提取与PCR扩增电泳图27
• 2.6.3 实时荧光定量PCR目的片段扩增产物鉴定27-28
• 2.6.4 实时荧光定量PCR结果28-29
• 2.7 讨论29-32
• 第三章 蛋白免疫印迹检测32-39
• 3.1 试验材料与方法32-33
• 3.1.1 试验材料32
• 3.1.2 主要仪器和设备32
• 3.1.3 主要试剂和药品32-33
• 3.2 试验方法与步骤33-35
• 3.2.1 主要试剂配制33-34
• 3.2.2 Trizol法提取外周血单个核细胞总蛋白34
• 3.2.3 Bradford法操作步骤34-35
• 3.2.3.1 绘制标准曲线34-35
• 3.2.3.2 检测样品蛋白含量35
• 3.3 SDS-PAGE电泳35-37
• 3.3.1 灌胶35
• 3.3.2 点样35-36
• 3.3.3 电泳36
• 3.3.4 转膜36
• 3.3.5 免疫反应36
• 3.3.6 化学发光、显影、定影36-37
• 3.4 结果与分析37-38
• 3.4.1 蛋白质浓度测定结果37-38
• 3.4.2 Western blot检测结果与分析38
• 3.5 讨论38-39
• 第四章 免疫细胞化学检测39-43
• 4.1 试验材料39
• 4.1.1 试验材料39
• 4.1.2 试验主要仪器和设备39
• 4.1.3 试验试剂和耗材39
• 4.2 试验方法与步骤39-41
• 4.2.1 主要试剂配制39
• 4.2.2 免疫细胞化学操作步骤39-41
• 4.3 试验结果与分析41-42
• 4.3.1 免疫细胞化学结果41-42
• 4.4 讨论42-43
• 第五章 全文总结43-44
• 5.1 本研究的主要结论和创新43
• 5.2 下一步研究计划43-44
• 致谢44-45
• 参考文献45-52
• 作者简介52
• 攻读硕士学位期间发表的论文52-53

【参考文献】

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本文编号：321895