鸭圆环病毒四川毒株的进化分析及感染性分子克隆的构建

发布时间：2021-06-10 01:00

　　鸭圆环病毒（Duck circovirus,DuCV）是近年来新发现的水禽感染性病原,造成鸭生长迟缓,体重下降等症状。病毒主要侵染鸭淋巴器官,患鸭后会引发免疫抑制及可能的二次感染,对养殖业造成了较大的经济损失。因此,分析我国DuCV的遗传演化规律并构建体外转录的模型具有十分重要的科学意义。1.DuCV的分离、鉴定及全基因组序列分析本研究从疑似感染DuCV的病鸭体内分离到一株DuCV（命名为DuCV-GH01）,通过PCR得到病毒全基因组进行序列分析表明,DuCV-GH01的核苷酸序列与目前GenBank登录的所有DuCV序列相似性高达81.8%～99.4%,根据PASC的p值/频率分布图获得,当不同基因组的p值大于0.170时,可分为DuCV1和DuCV2;当DuCVl和DuCV2的型间p值大于0.032或0.018时,可以将鸭圆环病毒细分为1a、1b、1c和2a、2b、2c 6个亚型。这个结果证明DuCV由一个共同祖先经过不同的进化过程分化为DuCV-1和DuCV-2。2. DuCV的基因重组及选择压力分析通过系统进化树分析发现利用全基因组进行分型时的3株DuCV-2a毒株（GenB... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
本论文的创新性工作
中文摘要
ABSTRACT
常用英文缩写词汇
第一部分 文献综述及研究目的和意义
    第一章 文献综述
        1. 国内外研究进展
        2. 研究的目的和意义
第二部分 试验研究
    第二章 鸭圆环病毒的分离、鉴定及基因分型
        1 材料
            1.1 病料、菌种和克隆载体
            1.2 主要试剂
            1.3 主要溶液
        2 方法
            2.1 病毒基因组DNA的提取
                2.1.1 病料的准备
                2.1.2 DNA提取
            2.2 PCR引物的设计
            2.3 DuCV特异片段的PCR扩增与检测
                2.3.1 PCR反应条件
                2.3.2 PCR循环参数
            2.4 DuCV全基因组的PCR扩增
                2.4.1 PCR反应条件
                2.4.2 PCR循环参数
            2.5 PCR产物的纯化与克隆
                2.5.1 全长片段的回收纯化
                2.5.2 全长片段与pMD18-T载体连接
                2.5.3 连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a
                2.5.4 阳性重组质粒的鉴定
            2.6 DuCV基因组的序列分析
            2.7 用于同源性比较和进化树构建的圆环病毒序列
        3 结果
            3.1 DuCV特异片段的检测结果
            3.2 DuCV的全基因组扩增
            3.3 鸭圆环病毒与其他不同宿主圆环病毒的亲缘关系
            3.4 鸭圆环病毒的基因分型
        4 讨论
    第三章 鸭圆环病毒的分子遗传进化分析
        1 材料
        2 方法
        3 结果
            3.1 鸭圆环病毒的基因重组分析
            3.2 鸭圆环病毒Cap和Rep蛋白氨基酸序列的进化演变
            3.3 自然选择压力
        4 讨论
    第四章 鸭圆环病毒感染性克隆的构建
        1 材料
            1.1 病毒与动物
            1.2 载体与菌株
            1.3 主要试剂
        2 方法
            2.1 引物设计
            2.2 双拷贝感染性克隆的构建
                2.2.1 双拷贝感染性克隆IC-1、IC-2的克隆
                2.2.2 PCR产物IC-1、IC-2与pUC19载体的连接
                2.2.3 双拷贝感染性克隆的连接
            2.3 遗传标记的引入
                2.3.1 融合PCR
                2.3.2 携带遗传标记的双拷贝克隆的构建
            2.4 感染性克隆的人工转染试验
                2.4.1 转染样品的制备
                2.4.2 转染
                2.4.3 样品采集与检测
                2.4.4 遗传标记的鉴定
        3 结果
            3.1 重组质粒pIC-2DuCV的构建与鉴定
                3.1.1 IC-1、IC-2的PCR扩增
                3.1.2 IC-1、IC-2与pUC19中间质粒的构建
                3.1.3 双拷贝感染性克隆pIC-2DuCV的构建
                3.1.4 携带遗传标记的双拷贝感染性克隆pIC-Mu2DuCV的构建
            3.2 感染性克隆的人工转染试验结果
        4 讨论
    第五章 鸭圆环病毒拯救毒株的部分生物学特性研究
        1 材料
            1.1 病毒
            1.2 试验动物
            1.3 相关试剂
        2 方法
            2.1 亲本毒株的准备
            2.2 动物攻毒试验
            2.3 临床检查
            2.4 DuCV病毒血症检测
            2.5 血清学检测DuCV Cap蛋白抗体的检测
            2.6 Real-time qPCR检测DuCV在不同器官中的分布
        3 结果
            3.1 临床观察
            3.2 病毒血症
            3.3 DuCV血清抗体检测
            3.4 荧光定量检测DuCV在不同器官中的分布与载量
        4 讨论
结论
参考文献
致谢
附录
    附录1 常用试剂的配置
        1.1 酚氯仿法抽提DNA的溶液
        1.2 感受态细胞制备及转化、诱导用溶液
        1.3 质粒大抽试剂
    附录2 试验器材
    附录3 DuCV-GH01(JX499186)全基因组序列
作者简介以及攻读硕士学位期间发表的学术论文



本文编号：3221689