木聚糖酶基因的突变及其在毕赤酵母中的表达
发布时间：2021-06-10 09:25
木聚糖是半纤维素的主要组成成分,而半纤维素广泛存在于植物细胞壁中,是自然界中含量仅次于纤维素的可再生资源。多种谷物饲料如小麦、大麦、燕麦等含有较多的木聚糖,影响了营养物质的利用与吸收,因此选择合适的木聚糖酶来降解木聚糖就十分必要。微生物产生的天然木聚糖酶酶多为混合酶,其产量和酶活较低制约了木聚糖酶的工业化生产和应用,采用基因工程技术获得活力好、产量高、性质稳定的木聚糖酶资源成为研究的热点。本试验采用RT-PCR技术扩增目的基因,将目的基因片段克隆到PMD19-T载体上,经测序检测后,与GenBank中已公布木聚糖酶基因序列对比发现,该木聚糖酶基因与已公布序列（黑曲霉Aspergillus niger C71（JF693944.1））的同源性高达100%,该基因的编码区不含信号肽序列,不含内含子序列,推测编码225个氨基酸,蛋白分子量约为24.13 kDa,蛋白等电点约为5.23。构建真核表达载体后,将其电击转化、筛选和鉴定,最终证实pGAPZaA-木聚糖酶基因重组质粒载体已成功整合入毕赤酵母中,重组酵母可分泌与预期目的蛋白大小相当的酶蛋白条带,证实了木聚糖酶基因在毕赤酵母中得到了成功表...
【文章来源】：河南农业大学河南省
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
第一章 文献综述
1.1 NSP、木聚糖及其降解酶
1.1.1 NSP与木聚糖
1.1.2 木聚糖的抗营养特性
1.1.3 木聚糖酶及其分类
1.2 木聚糖酶基因的研究进展
1.2.1 木聚糖酶基因的克隆
1.2.1.1 木聚糖酶基因的克隆方法
1.2.1.2 阳性克隆子的检测方法
1.2.1.3 克隆的木聚糖酶基因
1.2.2 木聚糖酶基因的表达体系
1.2.2.1 细菌表达体系
1.2.2.2 真菌表达体系
1.3 毕赤酵母表达系统的优越性
1.4 易错PCR技术
1.5 木聚糖酶的应用
1.5.1 木聚糖酶在造纸行业的应用
1.5.2 木聚糖酶在饲料行业的应用
1.5.3 木聚糖酶在食品行业的应用
1.5.4 木聚糖酶的其他应用
1.6 研究目的及意义
第二章 木聚糖酶基因的克隆及鉴定
2.1 试验材料
2.1.1 试验仪器
2.1.2 试验菌种与质粒
2.1.3 主要试剂
2.1.4 培养基和溶液
2.2 试验方法
2.2.1 引物设计
2.2.2 目的基因的获取
2.2.2.1 黑曲霉(Aspergillus niger)的培养
2.2.2.2 黑曲霉总RNA的提取
2.2.2.3 去除黑曲霉总RNA样品中的基因组DNA
2.2.2.4 RT-PCR
2.2.3 RT-PCR产物的纯化与回收
2.2.4 RT-PCR产物与PMD19-T载体的连接
2.2.5 连接产物的转化
2.2.6 阳性克隆子的筛选与鉴定
2.2.6.1 蓝白斑筛选
2.2.6.2 菌落PCR鉴定
2.2.6.3 重组质粒的提取及检测
2.3 结果与分析
2.3.1 黑曲霉木聚糖酶基因组总RNA的提取结果
2.3.2 黑曲霉木聚糖酶基因RT-PCR的扩增结果
2.3.3 重组克隆子的蓝白斑筛选结果
2.3.4 重组克隆子的鉴定
2.3.4.1 重组克隆子菌落PCR扩增结果
2.3.4.2 重组克隆子质粒提取及双酶切鉴定结果
2.3.4.3 重组克隆子质粒检测结果
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 木聚糖酶基因真核表达载体电击转化至毕赤酵母
3.1 试验材料
3.1.1 试验仪器
3.1.2 试验菌种与质粒
3.1.3 主要试剂
3.1.4 表达质粒pGAPZαA的图谱
3.1.5 培养基与溶液
3.1.5.1 培养基的配制
3.1.5.2 溶液的配制
3.2 试验方法
3.2.1 术聚糖酶基因真核表达载体的构建
3.2.1.1 黑曲霉木聚糖酶基因的纯化与回收
3.2.1.2 真核表达载体pGAPZαA的纯化与回收
3.2.1.3 木聚糖酶基因和真核表达载体pGAPZαA质粒的连接
3.2.1.4 连接产物转化至大肠杆菌
3.2.1.5 重组克隆子的筛选与鉴定
3.2.2 重组pGAPZαA-木聚糖酶基因质粒的电击转化
3.2.2.1 重组pGAPZαA-木聚糖酶基因质粒的线性化
3.2.2.2 毕赤酵母感受态细胞的制备
3.2.2.3 电击转化
3.2.2.4 重组酵母菌的鉴定
3.3 结果与分析
3.3.1 木聚糖酶基因真核表达载体的构建结果
3.3.1.1 重组克隆子的平板筛选结果
3.3.1.2 重组表达载体pGAPZαA-木聚糖酶基因的鉴定
3.3.2 重组酵母菌的鉴定
3.3.2.1 重组酵母菌的抗性筛选结果
3.3.2.2 重组毕赤酵母菌的菌落PCR鉴定结果
3.3.2.3 SDS-PAGE蛋白电泳检测结果
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 重组毕赤酵母产酶活性的检测
4.1 试验材料
4.1.1 试验仪器
4.1.2 试验菌种
4.1.3 主要试剂
4.1.4 培养基与溶液
4.1.4.1 培养基配制
4.1.4.2 溶液的配制
4.2 试验方法
4.2.1 重组酵母菌平板检测结果
4.2.2 木聚糖酶活力的检测方法
4.2.2.1 木糖标准曲线的测定
4.2.2.2 木聚糖酶活力的测定方法
4.2.3 不同碳源对重组酵母产酶活力的测定
4.2.3.1 粗酶液的制备
4.2.3.2 木聚糖酶活力的检测
4.2.4 不同重组酵母的产酶活力的测定
4.3 结果与分析
4.3.1 重组酵母菌平板检测结果
4.3.2 木糖标准曲线
4.3.3 不同碳源对重组酵母菌木聚糖酶活性的影响
4.3.4 不同重组酵母菌产酶活力的测定结果
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 利用易错PCR改变木聚糖酶基因
5.1 试验材料
5.2 试验方法
5.2.1 引物设计
5.2.2 木聚糖酶基因易错PCR扩增、转化及鉴定方法
5.2.2.1 质粒PCR扩增及产物的纯化与回收
5.2.2.2 易错PCR扩增及产物的纯化与回收
5.2.2.3 突变基因的克隆与筛选
5.2.3 重组表达质粒的构建与转化
5.3 结果与分析
5.3.1 易错PCR扩增结果
5.3.1.1 质粒PCR扩增及易错PCR扩增结果
5.3.1.2 重组克隆子的蓝白斑筛选结果
5.3.1.3 重组克隆子的鉴定
5.3.2 木聚糖酶突变基因真核表达载体的构建结果
5.3.2.1 重组克隆子的平板筛选结果
5.3.2.2 重组表达载体pGAPZαA-木聚糖酶突变体基因的鉴定
5.3.3 重组酵母菌的鉴定
5.3.3.1 重组酵母菌的抗性筛选结果
5.3.3.2 重组酵母的PCR鉴定结果
5.3.3.3 SDS-PAGE蛋白电泳检测结果
5.4 讨论
5.5 小结
第六章 突变株和原始基因重组酵母产酶活性及酶学性质的分析
6.1 试验材料
6.1.1 试验仪器
6.1.2 试验菌种
6.1.3 主要试剂及培养基
6.2 试验方法
6.2.1 不同重组酵母菌产酶活力的测定方法
6.2.1.1 粗酶液的制备
6.2.1.2 木聚糖酶活力的测定
6.2.2 培养时间对重组酵母产酶活力影响
6.2.3 木聚糖酶酶学性质的分析
6.2.3.1 不同温度处理对木聚糖酶活力的影响
6.2.3.2 不同pH处理对木聚糖酶活力的影响
6.2.4 添加0.2%的Tween80对木聚糖酶活力的影响
6.2.5 木聚糖酶对小麦中非淀粉多糖的降解
6.2.5.1 色谱条件
6.2.5.2 小麦的处理
6.2.5.3 粗酶液的制备
6.3 结果与分析
6.3.1 不同突变株产酶活力的测定结果
6.3.2 培养时间对重组酵母产酶活力的影响
6.3.3 不同温度处理对木聚糖酶活力的影响
6.3.4 不同pH处理对木聚糖酶活力的影响
6.3.5 添加0.2%的Tween80对木聚糖酶活力的影响
6.3.6 木聚糖酶对小麦中非淀粉多糖的降解结果
6.4 讨论
6.5 小结
总结
参考文献
Abstract
【参考文献】：
期刊论文
[1]黑曲霉木聚糖酶基因xynB的克隆及在酿酒酵母中的表达[J]. 张水龙,陈东,曹树威,吴仁智,黄日波. 广西科学. 2013(02)
[2]枯草芽孢杆菌木聚糖酶Xyn B在毕赤酵母中的表达[J]. 莫毅,梁方方,赖志强,卢玉发,廖玉英,何仁春,黄丽霞,杨琳. 中国饲料. 2012(09)
[3]基于易错PCR的黄曲霉毒素解毒酶体外分子定向进化[J]. 张赛,邢克克,胡亚冬,谢春芳,刘大岭,姚冬生. 生物工程学报. 2011(07)
[4]麦芽糖诱导耐碱性木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达[J]. 张云雁,杨明明,周煌凯,段春燕,龚月生. 西北农业学报. 2011(01)
[5]黑曲霉木聚糖酶基因xynA的克隆及真核表达载体的构建[J]. 张茂,刘德武,林纯,贺晓燕,孟繁明,周庆丰,杜云平,吴珍芳. 华中农业大学学报. 2010(05)
[6]黑曲霉木聚糖酶基因（xynB）的克隆及真核分泌表达[J]. 张茂,周庆丰,杜云平,刘德武,孟繁明,周美华,吴珍芳. 农业生物技术学报. 2010(02)
[7]极端耐热木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合表达[J]. 张伟,李冠,娄恺. 生物技术. 2010(01)
[8]不同类型日粮添加酶制剂对蛋品质和蛋鸭生产性能的影响[J]. 王景成,杨维仁,杨在宾,丁永敏,姜淑贞,张桂国. 中国粮油学报. 2009(01)
[9]不同比例小麦日粮添加木聚糖酶对肉鸡生产性能的影响[J]. 鲍淑青,王敏,杜红方,周镇锋. 饲料工业. 2008(22)
[10]木聚糖酶XynⅡ的D37N突变、表达及酶学性质变化[J]. 周晨妍,李东峰,邬敏辰,王武. 生物加工过程. 2008(03)
硕士论文
[1]木聚糖酶基因工程菌G81的构建及酶学性质研究[D]. 宋东蓥.河南师范大学 2010
[2]葡萄糖氧化酶的体外定向进化[D]. 刘丹.中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
[3]木聚糖酶对小麦日粮非淀粉多糖降解规律及其对肉仔鸡肠道组织形态的影响研究[D]. 雷丽.南京农业大学 2007
本文编号：3222120
【文章来源】：河南农业大学河南省
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
第一章 文献综述
1.1 NSP、木聚糖及其降解酶
1.1.1 NSP与木聚糖
1.1.2 木聚糖的抗营养特性
1.1.3 木聚糖酶及其分类
1.2 木聚糖酶基因的研究进展
1.2.1 木聚糖酶基因的克隆
1.2.1.1 木聚糖酶基因的克隆方法
1.2.1.2 阳性克隆子的检测方法
1.2.1.3 克隆的木聚糖酶基因
1.2.2 木聚糖酶基因的表达体系
1.2.2.1 细菌表达体系
1.2.2.2 真菌表达体系
1.3 毕赤酵母表达系统的优越性
1.4 易错PCR技术
1.5 木聚糖酶的应用
1.5.1 木聚糖酶在造纸行业的应用
1.5.2 木聚糖酶在饲料行业的应用
1.5.3 木聚糖酶在食品行业的应用
1.5.4 木聚糖酶的其他应用
1.6 研究目的及意义
第二章 木聚糖酶基因的克隆及鉴定
2.1 试验材料
2.1.1 试验仪器
2.1.2 试验菌种与质粒
2.1.3 主要试剂
2.1.4 培养基和溶液
2.2 试验方法
2.2.1 引物设计
2.2.2 目的基因的获取
2.2.2.1 黑曲霉(Aspergillus niger)的培养
2.2.2.2 黑曲霉总RNA的提取
2.2.2.3 去除黑曲霉总RNA样品中的基因组DNA
2.2.2.4 RT-PCR
2.2.3 RT-PCR产物的纯化与回收
2.2.4 RT-PCR产物与PMD19-T载体的连接
2.2.5 连接产物的转化
2.2.6 阳性克隆子的筛选与鉴定
2.2.6.1 蓝白斑筛选
2.2.6.2 菌落PCR鉴定
2.2.6.3 重组质粒的提取及检测
2.3 结果与分析
2.3.1 黑曲霉木聚糖酶基因组总RNA的提取结果
2.3.2 黑曲霉木聚糖酶基因RT-PCR的扩增结果
2.3.3 重组克隆子的蓝白斑筛选结果
2.3.4 重组克隆子的鉴定
2.3.4.1 重组克隆子菌落PCR扩增结果
2.3.4.2 重组克隆子质粒提取及双酶切鉴定结果
2.3.4.3 重组克隆子质粒检测结果
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 木聚糖酶基因真核表达载体电击转化至毕赤酵母
3.1 试验材料
3.1.1 试验仪器
3.1.2 试验菌种与质粒
3.1.3 主要试剂
3.1.4 表达质粒pGAPZαA的图谱
3.1.5 培养基与溶液
3.1.5.1 培养基的配制
3.1.5.2 溶液的配制
3.2 试验方法
3.2.1 术聚糖酶基因真核表达载体的构建
3.2.1.1 黑曲霉木聚糖酶基因的纯化与回收
3.2.1.2 真核表达载体pGAPZαA的纯化与回收
3.2.1.3 木聚糖酶基因和真核表达载体pGAPZαA质粒的连接
3.2.1.4 连接产物转化至大肠杆菌
3.2.1.5 重组克隆子的筛选与鉴定
3.2.2 重组pGAPZαA-木聚糖酶基因质粒的电击转化
3.2.2.1 重组pGAPZαA-木聚糖酶基因质粒的线性化
3.2.2.2 毕赤酵母感受态细胞的制备
3.2.2.3 电击转化
3.2.2.4 重组酵母菌的鉴定
3.3 结果与分析
3.3.1 木聚糖酶基因真核表达载体的构建结果
3.3.1.1 重组克隆子的平板筛选结果
3.3.1.2 重组表达载体pGAPZαA-木聚糖酶基因的鉴定
3.3.2 重组酵母菌的鉴定
3.3.2.1 重组酵母菌的抗性筛选结果
3.3.2.2 重组毕赤酵母菌的菌落PCR鉴定结果
3.3.2.3 SDS-PAGE蛋白电泳检测结果
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 重组毕赤酵母产酶活性的检测
4.1 试验材料
4.1.1 试验仪器
4.1.2 试验菌种
4.1.3 主要试剂
4.1.4 培养基与溶液
4.1.4.1 培养基配制
4.1.4.2 溶液的配制
4.2 试验方法
4.2.1 重组酵母菌平板检测结果
4.2.2 木聚糖酶活力的检测方法
4.2.2.1 木糖标准曲线的测定
4.2.2.2 木聚糖酶活力的测定方法
4.2.3 不同碳源对重组酵母产酶活力的测定
4.2.3.1 粗酶液的制备
4.2.3.2 木聚糖酶活力的检测
4.2.4 不同重组酵母的产酶活力的测定
4.3 结果与分析
4.3.1 重组酵母菌平板检测结果
4.3.2 木糖标准曲线
4.3.3 不同碳源对重组酵母菌木聚糖酶活性的影响
4.3.4 不同重组酵母菌产酶活力的测定结果
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 利用易错PCR改变木聚糖酶基因
5.1 试验材料
5.2 试验方法
5.2.1 引物设计
5.2.2 木聚糖酶基因易错PCR扩增、转化及鉴定方法
5.2.2.1 质粒PCR扩增及产物的纯化与回收
5.2.2.2 易错PCR扩增及产物的纯化与回收
5.2.2.3 突变基因的克隆与筛选
5.2.3 重组表达质粒的构建与转化
5.3 结果与分析
5.3.1 易错PCR扩增结果
5.3.1.1 质粒PCR扩增及易错PCR扩增结果
5.3.1.2 重组克隆子的蓝白斑筛选结果
5.3.1.3 重组克隆子的鉴定
5.3.2 木聚糖酶突变基因真核表达载体的构建结果
5.3.2.1 重组克隆子的平板筛选结果
5.3.2.2 重组表达载体pGAPZαA-木聚糖酶突变体基因的鉴定
5.3.3 重组酵母菌的鉴定
5.3.3.1 重组酵母菌的抗性筛选结果
5.3.3.2 重组酵母的PCR鉴定结果
5.3.3.3 SDS-PAGE蛋白电泳检测结果
5.4 讨论
5.5 小结
第六章 突变株和原始基因重组酵母产酶活性及酶学性质的分析
6.1 试验材料
6.1.1 试验仪器
6.1.2 试验菌种
6.1.3 主要试剂及培养基
6.2 试验方法
6.2.1 不同重组酵母菌产酶活力的测定方法
6.2.1.1 粗酶液的制备
6.2.1.2 木聚糖酶活力的测定
6.2.2 培养时间对重组酵母产酶活力影响
6.2.3 木聚糖酶酶学性质的分析
6.2.3.1 不同温度处理对木聚糖酶活力的影响
6.2.3.2 不同pH处理对木聚糖酶活力的影响
6.2.4 添加0.2%的Tween80对木聚糖酶活力的影响
6.2.5 木聚糖酶对小麦中非淀粉多糖的降解
6.2.5.1 色谱条件
6.2.5.2 小麦的处理
6.2.5.3 粗酶液的制备
6.3 结果与分析
6.3.1 不同突变株产酶活力的测定结果
6.3.2 培养时间对重组酵母产酶活力的影响
6.3.3 不同温度处理对木聚糖酶活力的影响
6.3.4 不同pH处理对木聚糖酶活力的影响
6.3.5 添加0.2%的Tween80对木聚糖酶活力的影响
6.3.6 木聚糖酶对小麦中非淀粉多糖的降解结果
6.4 讨论
6.5 小结
总结
参考文献
Abstract
【参考文献】：
期刊论文
[1]黑曲霉木聚糖酶基因xynB的克隆及在酿酒酵母中的表达[J]. 张水龙,陈东,曹树威,吴仁智,黄日波. 广西科学. 2013(02)
[2]枯草芽孢杆菌木聚糖酶Xyn B在毕赤酵母中的表达[J]. 莫毅,梁方方,赖志强,卢玉发,廖玉英,何仁春,黄丽霞,杨琳. 中国饲料. 2012(09)
[3]基于易错PCR的黄曲霉毒素解毒酶体外分子定向进化[J]. 张赛,邢克克,胡亚冬,谢春芳,刘大岭,姚冬生. 生物工程学报. 2011(07)
[4]麦芽糖诱导耐碱性木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达[J]. 张云雁,杨明明,周煌凯,段春燕,龚月生. 西北农业学报. 2011(01)
[5]黑曲霉木聚糖酶基因xynA的克隆及真核表达载体的构建[J]. 张茂,刘德武,林纯,贺晓燕,孟繁明,周庆丰,杜云平,吴珍芳. 华中农业大学学报. 2010(05)
[6]黑曲霉木聚糖酶基因（xynB）的克隆及真核分泌表达[J]. 张茂,周庆丰,杜云平,刘德武,孟繁明,周美华,吴珍芳. 农业生物技术学报. 2010(02)
[7]极端耐热木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合表达[J]. 张伟,李冠,娄恺. 生物技术. 2010(01)
[8]不同类型日粮添加酶制剂对蛋品质和蛋鸭生产性能的影响[J]. 王景成,杨维仁,杨在宾,丁永敏,姜淑贞,张桂国. 中国粮油学报. 2009(01)
[9]不同比例小麦日粮添加木聚糖酶对肉鸡生产性能的影响[J]. 鲍淑青,王敏,杜红方,周镇锋. 饲料工业. 2008(22)
[10]木聚糖酶XynⅡ的D37N突变、表达及酶学性质变化[J]. 周晨妍,李东峰,邬敏辰,王武. 生物加工过程. 2008(03)
硕士论文
[1]木聚糖酶基因工程菌G81的构建及酶学性质研究[D]. 宋东蓥.河南师范大学 2010
[2]葡萄糖氧化酶的体外定向进化[D]. 刘丹.中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
[3]木聚糖酶对小麦日粮非淀粉多糖降解规律及其对肉仔鸡肠道组织形态的影响研究[D]. 雷丽.南京农业大学 2007
本文编号：3222120
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