抗鹅坦布苏病毒JS804株NS1蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

发布时间：2021-06-10 20:47

　　安徽、山东、江苏、浙江、福建等鸭、鹅养殖大省,自2010年4月以来,鸭、鹅发生了一种以产蛋量、采食量迅速减少,拉绿色稀粪且有脑炎样神经症状的传染病,感染率高达100%,发病率和死亡率在5%～30%之间,产蛋率一般从70%～90%下降至10%以内甚至完全停产。2011年9月,该病再次大面积爆发,临床症状与2010年相似,对我国家禽养殖业再次造成巨大的经济损失。鸭病毒性脑炎、鸭鹅脑炎-卵巢炎综合征或鸭传染性产蛋减少综合症等名称,在2011年中国畜牧兽医学会第一届水禽疫病防控研讨会上,将该病统一命名为鸭坦布苏病毒病。坦布苏病毒感染动物后可形成分泌型NS1蛋白,在出现临床症状之前,可检测到分泌到血清中的NS1蛋白。针对NS1蛋白的这一特性,本研究制备了抗坦布苏病毒NS1蛋白的单克隆抗体,建立了双抗体夹心ELISA检测方法,用于坦布苏病毒感染的早期诊断,可减少因疾病大面积爆发而造成巨大的经济损失。本试验用鹅坦布苏病毒JS804株病毒免疫8周龄左右的BALB/c雌鼠,采用传统杂交瘤技术,用原核表达的纯化的NS1蛋白进行筛选,获得5株分泌特异性抗坦布苏病毒NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：88 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩写词表
第一篇 文献综述
    第一章 坦布苏病毒的研究进展
        1 坦布苏病毒病的概述
        2 病原学
            2.1 病毒的结构
            2.2 病毒的生物学特性
        3 流行情况
        4 坦布苏病毒病的诊断
            4.1 临床诊断
            4.2 病原检测
            4.3 血清学检测抗体
        5 国内疫苗的研究进展
            5.1 灭活疫苗
            5.2 弱毒疫苗
            5.3 基因工程亚单位疫苗
            5.4 基因工程活载体疫苗
            5.5 核酸疫苗
            5.6 合成肽疫苗
        6 实验动物感染模型
        7 防控措施
        8 坦布苏病毒的NS1蛋白
            8.1 NS1蛋白
            8.2 NS1蛋白的研究进展
            8.3 展望
        参考文献
第二篇 试验部分
    第一章 抗鹅坦布苏病毒JS804株NS1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
        1 材料
            1.1 病毒
            1.2 试验动物
            1.3 试验试剂
            1.4 主要仪器设备
        2 方法
            2.1 免疫抗原的制备
            2.2 筛选用抗原NS1的大量制备和纯化
            2.3 免疫动物
            2.4 单克隆抗体检测方法
            2.5 单克隆抗体的制备
            2.6 杂交瘤细胞的克隆化
            2.7 大量制备单克隆抗体
            2.8 单克隆抗体的鉴定
        3 结果
            3.1 免疫抗原的制备和效价的测定
            3.2 筛选抗原(NS1)的制备与纯化
            3.3 ELISA检测方法的建立
            3.4 建立杂交瘤细胞株
            3.5 纯化单抗腹水
            3.6 单抗的鉴定
                3.6.1 纯化的单抗ELISA效价测定
                3.6.2 单抗特异性的鉴定
            3.7 间接免疫荧光(IFA)
            3.8 单抗的体外中和试验
            3.9 体内中和试验
        4 讨论
            4.1 免疫原的制备
            4.2 细胞融合
            4.3 杂交瘤细胞的筛选
            4.4 亚克隆
        参考文献
    第二章 检测鹅坦布苏病毒双抗体夹心ELISA方法的建立
        1 材料
        2 方法
            2.1 兔抗鹅坦布苏病毒多抗的制备
            2.2 单抗的制备
            2.3 单抗腹水的纯化
            2.4 双抗体夹心ELISA方法的建立
            2.5 样品阴阳性判定标准的确定
            2.6 敏感性实验
            2.7 特异性实验
            2.8 重复性试验
            2.9 符合率试验
        3 结果
            3.1 兔抗鹅坦布苏病毒多抗血清的制备
            3.2 兔抗鹅坦布苏病毒多抗血清的纯化和蛋白含量的测定
            3.3 单抗腹水的纯化
            3.4 捕获抗体(兔多抗)和检测抗体(4A9)最佳稀释度的确定
            3.5 封闭时间的确定
            3.6 封闭液的选择
            3.7 抗原反应时间的确定
            3.8 单抗作用时间的确定
            3.9 酶标羊抗鼠二抗作用时间的确定
            3.10 酶标羊抗鼠二抗最佳稀释度的确定
            3.11 底物显色时间的确定
            3.12 阴阳性判定标准的确定
            3.13 敏感性试验
            3.14 特异性试验
            3.15 重复性试验
            3.16 符合率试验
        4 讨论
        参考文献
    第三章 双抗体夹心ELISA与套式RT-PCR检测鸭坦布苏病毒的比较
        1 材料
            1.1 病毒
            1.2 实验动物
            1.3 试剂和耗材
        2 方法
            2.1 鹅坦布苏病毒的大量制备
            2.2 动物试验
        3 检测试验
            3.1 双夹心ELISA方法检测
            3.2 套式RT-PCR方法检测
                3.2.1 套式RT-PCR方法的建立
        4 实验结果
            4.1 病毒感染不同天数检测结果的比较
            4.2 两种方法检测结果的符合率
        5 讨论
        参考文献
全文总结
附录：常用试剂的配制
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]促进细胞融合和杂交瘤细胞过快生长的方法[J]. 谷敬丽,房娜.  黑龙江科技信息. 2013(29)
[2]登革病毒EDⅢ特异性单抗的体内外中和活性观察[J]. 黄艳芬,邓永强,丘立文,刘利东,秦鄂德,车小燕,秦成峰.  军事医学. 2013(05)
[3]猪传染性胃肠炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立[J]. 屈月,葛俊伟,唐丽杰,乔薪瑗,姜艳平,尹光昕,李一经.  中国预防兽医学报. 2013(05)
[4]检测BDV抗原的双抗夹心ELISA法的建立[J]. 黄艺婧,刘赛,徐平,刘海军,李薇,邓旎.  免疫学杂志. 2013(05)
[5]鸭坦布苏病毒病研究进展[J]. 李宁,相海苓,刘立涛,李超,岳瑞超,刘思当.  水禽世界. 2013(02)
[6]鸭坦布苏病毒在雏麻鸭体内的分布及排毒[J]. 陈雷,傅光华,黄瑜,祁保民,傅秋玲,施少华,程龙飞,万春和,陈红梅,陈翠腾,林芳,林建生.  中国动物传染病学报. 2013(02)
[7]体外抗鸭坦布苏病毒的药物筛选[J]. 刘友生,陆新浩,白露,陈秋英,刘鸿,廖敏,周继勇,任祖伊.  中国动物传染病学报. 2013(02)
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[9]禽白血病病毒衣壳蛋白单克隆抗体研制及其双夹心ELISA的建立[J]. 尹丽萍,秦爱建,钱琨,邵红霞,金文杰,史荣华,梁有志,杭柏林,孙薇薇.  中国家禽. 2013(03)
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硕士论文
[1]鸭坦布苏病毒病发病模型的建立及免疫抗体持续期的测定[D]. 周晓波.南京农业大学 2012
[2]鸭坦布苏病毒分离鉴定及其生物学特性的研究[D]. 颜丕熙.中国农业科学院 2012
[3]主要虫媒病毒基因芯片检测方法的建立[D]. 朱晓光.中国人民解放军军事医学科学院 2007
[4]非结构蛋白NS1在登革病毒感染早期诊断及分型诊断中的作用[D]. 徐华.第一军医大学 2006



本文编号：3223095