兔出血症病毒（RHDV）与兔出血症病毒2型（RHDV2）的RT-PCR检测方法研究

发布时间：2017-04-23 18:00

  本文关键词：兔出血症病毒（RHDV）与兔出血症病毒2型（RHDV2）的RT-PCR检测方法研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease, RHD),俗称兔瘟,是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)引起的兔的一种急性、高度致死性传染病。RHD以呼吸系统出血,实质器官淤血、肿大、出血和肝脏坏死为主要病变特征,主要危害2月龄以上的养殖和野生的多个穴兔品种,死亡率达80%-100%。RHD于1984年被我国首次报道后,在世界很多国家出现发病和流行的报道,严重威胁着世界养兔业的健康发展,被国际动物卫生组织列为法定通过动物疫病。2010年在法国出现了由RHDV新种即兔出血症病毒2型(rabbit hemorrhagic disease virus 2, RHDV2)引起的能感染致死30日龄以内的兔r和传统RHDV毒株灭活苗的免疫过的兔子的新型兔病毒性出血症(new rabbit hemorrhagic disease, nRHD),也称为兔病毒性出血症2型(rabbit hemorrhagic disease type 2, RHD2)近年来RHD2已扩散至意大利、西班牙、德国、葡萄牙、英国、挪威等多数西欧国家和亚速尔群岛等国。我国目前尚无该病发生及其相关的研究报道,为此本研究在对RHDV2和RHDV基因序列分析基础上对其RT-PCR检测技术进行了初步研究,具体如下：为建立用于兔出血症病毒2型(RHDV2)的快速检测方法。根据GenBank已公布的RHDV和RHDV2 VP60基因,设计合成2对特异性引物和10条搭桥引物,通过搭桥PCR人工合成RHDV2 VP60基因中保守区片段,构建重组质粒,并以其为模板,经过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验和35份样品检测应用,初步建立RHDV2 RT-PCR检测方法。结果表明成功合成RHDV2 VP60基因的435 bp保守片段和构建了pMD-19T-RHDV2重组质粒以及pMD-19T-RHDV441,初步建立的RHDV2 RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,RHDV2的检测限度可达到230个拷贝的靶基因片段,检测RHDV、pGM-T-EBHSV(已构建)、兔源巴氏杆菌、兔源大肠杆菌和兔源沙门氏菌均无特异性扩增。样品检测结果显示样品中RHDV2核酸阴性。为建立用于兔出血症病毒(RHDV)与兔出血症病毒2型(RHDV2)鉴别诊断的检测方法,根据GenBank已公布的RHDV和RHDV2的VP60基因,在上面研究的基础上又设计合成1对特异性引物,采用RT-PCR和搭桥PCR技术分别获取RHDV和RHDV2的VP60基因中保守区片段,构建重组质粒pMD-19T-RHDV2、 pMD-19T-RHDV441(上面已构建)和pMD-19T-RHDV294,并以其为模板,经过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验,以及人工感染RHDV样品和临床样品的应用,对RHDV与RHDV2的复合RT-PCR检测方法进行了初步研究。结果显示建立的RHDV与RHDV2复合RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可分别扩增山RHDV和RHDV2的VP60保守区基因片段大小为294 bp和435 bp, RHDV与RHDV2的检测限度分别为160和230个拷贝的靶基因片段,而pGM-T-EBHSV(已构建)、兔源巴氏杆菌、兔源大肠杆菌和兔源沙门氏菌等病原的检测结果均为阴性。样品检测结果显示人工感染样品的RHDV检出率为100%(5/5),30份临床检样RHDV和RHDV2检测结果均为阴性。本研究为我国进行RHDV2的防控提供了一种技术储备和奠定了基础,同时为RHDV和RHDV2的鉴别与流行病学调查提供了科学方法和科学参考。
【关键词】：兔病毒性出血症 RHDV RHDV2 RT-PCR 搭桥PCR
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.291
【目录】：

• 摘要4-6
• 英文摘要6-10
• 综述部分10-24
• 第一章 兔出血症病毒及其检测技术10-24
• 1.1 兔瘟病毒(RHDV)10-17
• 1.1.1 结构特征11-14
• 1.1.1.1 病毒形态结构11
• 1.1.1.2 基因组结构特征与病毒蛋白11-14
• 1.1.2 理化特征与培养特性14
• 1.1.3 分类地位与分型14-16
• 1.1.3.1 分类地位14-15
• 1.1.3.2 毒株分型15-16
• 1.1.4 病毒的起源16-17
• 1.2 RHDV检测诊断技术17-22
• 1.2.1 初诊17-18
• 1.2.2 实验室检测诊断技术18-22
• 1.2.2.1 电镜技术18
• 1.2.2.2 血凝-血凝抑制试验(HA-HIA)18-19
• 1.2.2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)19-20
• 1.2.2.4 分子生物学技术20-22
• 1.3 本研究的目的意义22-24
• 试验研究24-42
• 第二章 兔出血症病毒2型VP60基因保守区人工合成及RT-PCR检测方法初探24-34
• 2.1 材料与方法24-29
• 2.1.1 试剂与样品24-25
• 2.1.2 引物设计25-26
• 2.1.3 RHDV2 VP60基因靶片段的人工合成26-28
• 2.1.3.1 搭桥PCR26-27
• 2.1.3.2 目的基因重组质粒的构建27-28
• 2.1.4 RHDV VP60基因靶片段的克隆鉴定28
• 2.1.5 反应条件的优化28
• 2.1.6 RHDV2 RT-PCR敏感性试验28
• 2.1.7 RHDV2 RT-PCR特异性试验28
• 2.1.8 初步应用试验28-29
• 2.2 结果29-32
• 2.2.1 RHDV2和RHDV靶基因片段的克隆鉴定29-31
• 2.2.2 反应条件的优化31
• 2.2.3 RHDV2 RT-PCR的敏感性和特异性31-32
• 2.2.4 样品检测32
• 2.3 讨论32-34
• 第三章 兔出血症病毒与兔出血症病毒2型复合RT-PCR检测方法的初步研究34-42
• 3.1 材料与方法34-36
• 3.1.1 试剂与样品34-35
• 3.1.2 引物设计35
• 3.1.3 RHDV与RHDV2靶基因片段的克隆鉴定35-36
• 3.1.3.1 RHDV2 VP60靶基因片段的人工合成35
• 3.1.3.2 RHDV VP60基因靶片段的扩增35
• 3.1.3.3 RHDV2与RHDV靶基因片段的克隆鉴定35-36
• 3.1.4 反应条件的优化36
• 3.1.5 复合RT-PCR敏感性试验36
• 3.1.6 复合RT-PCR特异性试验36
• 3.1.7 初步应用试验36
• 3.2 结果36-40
• 3.2.1 RHDV2和RHDV靶基因片段的克隆鉴定36-38
• 3.2.2 反应条件的确立38
• 3.2.3 复合RT-PCR的敏感性和特异性38-40
• 3.2.4 样品检测40
• 3.3 讨论40-42
• 结论部分42-43
• 第四章 结论42-43
• 参考文献43-48
• 致谢48-49
• 个人简介49

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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  本文关键词：兔出血症病毒（RHDV）与兔出血症病毒2型（RHDV2）的RT-PCR检测方法研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：322762