日本乙型脑炎病毒NS3蛋白酶的抑制剂高通量筛选及单克隆抗体的制备
发布时间：2021-06-14 04:57
日本乙型脑炎（Japanese encephalitis,JE）,是由乙型脑炎病毒引起的一种中枢神经系统疾病。该病可以感染人和多种动物,并造成不可逆的神经损害。2006年在我国山西运城发生流行性乙型脑炎,造成60人感染,其中19人死亡,社会影响巨大。在动物的感染中,猪群最易感染,怀孕母猪可表现为流产、高热、死胎,公猪则出现睾丸炎,给养殖业造成了巨大的经济损失,因此日本乙型脑炎成为严重的公共安全问题。到目前为止,还没有针对JEV的特异性治疗药物,所以,寻找治疗JEV的药物和方法是非常必要的。JEVNS3蛋白酶在JEV多聚蛋白水解过程中起着重要的作用,是乙型脑炎病毒复制所必需的。因此NS3蛋白酶己经被很多研究者们所关注,成为一个治疗乙型脑炎的潜在药物靶标。目前针对HCV NS3蛋白酶为靶标已筛选出药物特拉匹韦（telaprevir,VX-950）和波普瑞韦（boceprevir,SCH-503034）,然而针对JEV蛋白酶抑制剂的研究几乎还没有报道。本研究大量纯化了可溶性的JEV NS3蛋白酶,并且用荧光共振能量转移方法（FRET）检测了此蛋白酶的活性,在此基础上建立了高通量筛选方法。对实...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第一章 文献综述
1.1 日本乙型脑炎的流行病学
1.2 日本乙型脑炎病毒的分子生物学研究
1.3 黄病毒NS2B/NS3蛋白酶的功能研究
1.4 黄病毒NS2B/NS3蛋白酶复合物的晶体结构研究
1.5 NS2B/NS3蛋白酶抑制剂的研究进展
1.6 药物高通量筛选的研究和分子碎片药物的设计
1.6.1 药物高通量筛选的研究
1.6.2 分子碎片药物设计
第二章 研究目的与意义
第三章 JEV NS3蛋白酶抑制剂的高通量筛选
3.1 实验材料
3.1.1 质粒和菌株
3.1.2 荧光底物的设计
3.1.3 相关试剂和药品
3.1.4 抗生素和培养基的配制
3.1.5 缓冲液及各种试剂的配制
3.1.6 化合物库
3.2 实验方法
3.2.1 质粒的转化
3.2.2 质粒的提取和酶切鉴定
3.2.3 重组蛋白的大量诱导表达、纯化
3.2.4 蛋白酶浓度的测定(BCA法)
3.2.5 蛋白酶的活性检测及高通量筛选体系的确定
3.2.6 DMSO对JEV NS2B/NS3蛋白酶活性的影响
3.2.7 Aprotinin对NS2B/NS3蛋白酶的抑制作用
3.2.8 基于JEV NS3蛋白酶活性的小分子抑制剂筛选
3.2.8.1 化合物碎片库的初筛
3.2.8.2 化合物碎片库的复筛
3.2.8.3 阳性抑制剂对WNV和DENV NS2B/NS3pro的抑制效果
3.2.9 基于细胞水平的蛋白酶抑制剂的抗病毒活性研究
3.2.9.1 化合物抑制JEV的细胞病变效应
3.2.9.2 Western blot分析小分子化合物的抗病毒活性
3.2.9.3 间接免疫荧光试验
3.3 结果与分析
3.3.1 质粒的双酶切鉴定
3.3.2 三种病毒的NS2B/NS3Pro的Ni~(2+)-亲和层析纯化
3.3.3 蛋白酶的酶切活性检测
3.3.4 DMSO对JEV NS2B/NS3蛋白酶活性的影响
3.3.5 Aprotinin对NS2B/NS3蛋白酶的抑制
3.3.6 蛋白酶抑制剂高通量筛选
3.3.6.1 小分子碎片库的初步筛选
3.3.6.2 小分子化合物的复筛
3.3.6.3 阳性化合物对WNV、DENV NS2B/NS3pro的抑制效果
3.3.7 基于细胞水平的蛋白酶抑制剂的抗病毒活性研究
3.3.7.1 化合物抑制JEV的细胞病变效应
3.3.7.2 Western blot试验
3.3.7.3 间接免疫荧光试验
3.3.7.4 化合物与蛋白互作位点的预测
3.4 讨论
3.4.1 蛋白酶在E.coli中的表达和纯化
3.4.2 小分子抑制剂的高通量筛选
3.4.3 阳性抑制剂在WNV、DENV NS2B/NS3蛋白酶上的抑制
3.4.4 阳性抑制剂在细胞水平上的抗病毒研究
3.5 结论
第四章 JEV NS3蛋白酶单克隆抗体的制备
4.1 实验材料
4.1.1 细胞及实验动物
4.1.2 主要药品及试剂
4.1.3 主要培养基及其配制
4.1.4 主要缓冲溶液及其配制
4.2 试验方法
4.2.1 免疫原和检测抗原的制备
4.2.2 动物免疫
4.2.3 间接ELISA检测方法的建立
4.2.4 间接ELISA方法检测免疫小鼠的血清效价
4.2.5 SP2/0骨髓瘤细胞的制备
4.2.6 免疫脾细胞的制备
4.2.7 细胞融合
4.2.8 阳性杂交瘤细胞的筛选
4.2.9 阳性杂交瘤细胞的亚克隆
4.2.10 杂交瘤细胞的冻存
4.2.11 单克隆抗体的大量制备
4.2.12 单克隆抗体的效价鉴定
4.2.13 单克隆抗体的间接免疫荧光检测
4.2.14 单克隆抗体的Western blot检测
4.3 结果与分析
4.3.1 间接ELISA检测方法的建立
4.3.2 免疫小鼠血清效价测定
4.3.3 杂交瘤细胞株的筛选与建立
4.3.4 单克隆抗体的效价测定
4.3.5 单克隆抗体的间接免疫荧光检测
4.3.6 单克隆抗体的Western blot分析
4.4 讨论
4.4.1 动物免疫
4.4.2 细胞融合
4.4.3 特异性单克隆抗体的筛选
4.4.4 单克隆抗体特异性的鉴定
4.5 结论
参考文献
致谢
本文编号：3229116
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第一章 文献综述
1.1 日本乙型脑炎的流行病学
1.2 日本乙型脑炎病毒的分子生物学研究
1.3 黄病毒NS2B/NS3蛋白酶的功能研究
1.4 黄病毒NS2B/NS3蛋白酶复合物的晶体结构研究
1.5 NS2B/NS3蛋白酶抑制剂的研究进展
1.6 药物高通量筛选的研究和分子碎片药物的设计
1.6.1 药物高通量筛选的研究
1.6.2 分子碎片药物设计
第二章 研究目的与意义
第三章 JEV NS3蛋白酶抑制剂的高通量筛选
3.1 实验材料
3.1.1 质粒和菌株
3.1.2 荧光底物的设计
3.1.3 相关试剂和药品
3.1.4 抗生素和培养基的配制
3.1.5 缓冲液及各种试剂的配制
3.1.6 化合物库
3.2 实验方法
3.2.1 质粒的转化
3.2.2 质粒的提取和酶切鉴定
3.2.3 重组蛋白的大量诱导表达、纯化
3.2.4 蛋白酶浓度的测定(BCA法)
3.2.5 蛋白酶的活性检测及高通量筛选体系的确定
3.2.6 DMSO对JEV NS2B/NS3蛋白酶活性的影响
3.2.7 Aprotinin对NS2B/NS3蛋白酶的抑制作用
3.2.8 基于JEV NS3蛋白酶活性的小分子抑制剂筛选
3.2.8.1 化合物碎片库的初筛
3.2.8.2 化合物碎片库的复筛
3.2.8.3 阳性抑制剂对WNV和DENV NS2B/NS3pro的抑制效果
3.2.9 基于细胞水平的蛋白酶抑制剂的抗病毒活性研究
3.2.9.1 化合物抑制JEV的细胞病变效应
3.2.9.2 Western blot分析小分子化合物的抗病毒活性
3.2.9.3 间接免疫荧光试验
3.3 结果与分析
3.3.1 质粒的双酶切鉴定
3.3.2 三种病毒的NS2B/NS3Pro的Ni~(2+)-亲和层析纯化
3.3.3 蛋白酶的酶切活性检测
3.3.4 DMSO对JEV NS2B/NS3蛋白酶活性的影响
3.3.5 Aprotinin对NS2B/NS3蛋白酶的抑制
3.3.6 蛋白酶抑制剂高通量筛选
3.3.6.1 小分子碎片库的初步筛选
3.3.6.2 小分子化合物的复筛
3.3.6.3 阳性化合物对WNV、DENV NS2B/NS3pro的抑制效果
3.3.7 基于细胞水平的蛋白酶抑制剂的抗病毒活性研究
3.3.7.1 化合物抑制JEV的细胞病变效应
3.3.7.2 Western blot试验
3.3.7.3 间接免疫荧光试验
3.3.7.4 化合物与蛋白互作位点的预测
3.4 讨论
3.4.1 蛋白酶在E.coli中的表达和纯化
3.4.2 小分子抑制剂的高通量筛选
3.4.3 阳性抑制剂在WNV、DENV NS2B/NS3蛋白酶上的抑制
3.4.4 阳性抑制剂在细胞水平上的抗病毒研究
3.5 结论
第四章 JEV NS3蛋白酶单克隆抗体的制备
4.1 实验材料
4.1.1 细胞及实验动物
4.1.2 主要药品及试剂
4.1.3 主要培养基及其配制
4.1.4 主要缓冲溶液及其配制
4.2 试验方法
4.2.1 免疫原和检测抗原的制备
4.2.2 动物免疫
4.2.3 间接ELISA检测方法的建立
4.2.4 间接ELISA方法检测免疫小鼠的血清效价
4.2.5 SP2/0骨髓瘤细胞的制备
4.2.6 免疫脾细胞的制备
4.2.7 细胞融合
4.2.8 阳性杂交瘤细胞的筛选
4.2.9 阳性杂交瘤细胞的亚克隆
4.2.10 杂交瘤细胞的冻存
4.2.11 单克隆抗体的大量制备
4.2.12 单克隆抗体的效价鉴定
4.2.13 单克隆抗体的间接免疫荧光检测
4.2.14 单克隆抗体的Western blot检测
4.3 结果与分析
4.3.1 间接ELISA检测方法的建立
4.3.2 免疫小鼠血清效价测定
4.3.3 杂交瘤细胞株的筛选与建立
4.3.4 单克隆抗体的效价测定
4.3.5 单克隆抗体的间接免疫荧光检测
4.3.6 单克隆抗体的Western blot分析
4.4 讨论
4.4.1 动物免疫
4.4.2 细胞融合
4.4.3 特异性单克隆抗体的筛选
4.4.4 单克隆抗体特异性的鉴定
4.5 结论
参考文献
致谢
本文编号：3229116
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3229116.html
