布鲁氏菌免疫磁珠qPCR检测方法的建立及应用
发布时间：2021-06-14 06:51
为建立高效、快速和准确检测布鲁氏菌病原的免疫磁珠qPCR方法,本研究根据GenBank已经发表的布鲁氏菌流产株BRS 19 ku外膜蛋白（Omp19）基因组序列来设计qPCR方法所需要的引物和探针,利用免疫磁珠富集浓缩样品中少量的布鲁氏菌病原,建立了布鲁氏菌免疫磁珠qPCR检测方法。采用qPCR方法对免疫磁珠分离的布鲁氏菌的敏感性、特异性、稳定性及临床应用进行了研究。结果显示,免疫磁珠qPCR方法检测布鲁氏菌的最低检测限为1×103CFU/mL。该方法可以扩增不同种型布鲁氏菌,对其他细菌没有发生交叉反应。该方法的批内和批间的变异系数均低于10%,具有较高稳定性。免疫磁珠qPCR方法与常规qPCR的符合率为94.74%,具有良好的吻合性。上述结果表明,本研究建立的免疫磁珠qPCR方法检测布鲁氏菌具有较高的敏感性、特异性和稳定性,为布鲁氏菌病的准确诊断检测和流行病学调查提供技术支撑。
【文章来源】：中国兽医科学. 2020,50(10)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
布鲁氏菌单克隆抗体纯化的SDS-PAGE分析
中国兽医科学第50卷图2免疫磁珠qPCR方法的特异性检测Figure2SpecificresultsofimmunomagneticbeadqPCRmethodS1：M5疫苗；S2：A19疫苗；S3：S2疫苗；S4：大肠杆菌；S5：小肠耶尔森氏菌；S6：金黄色葡萄球菌；S7：沙门菌。S1：M5vaccine；S2：A19vaccine；S3：S2vaccine；S4：E.coli；S5：Y.ente-rocolitica；S6：S.aureus；S7：Salmonel.图3免疫磁珠qPCR方法的敏感性检测Figure3SensitivitytestofimmunomagneticbeadqPCRmethod图1布鲁氏菌单克隆抗体纯化的SDS-PAGE分析Figure1SDS-PAGEanalysisofBrucellamonoclonalanti-bodypurificationM：蛋白分子质量Marker；1～2：流穿液；3～5：洗涤液；6～8：纯化后布鲁氏菌单克隆抗体。M：ProteinmolecularweightMarker；1—2：Flowthroughsolution；3—5：Washingsolution；6—8：PurifiedBrucellamonoclonalantibody.次和3个不同批次的免疫磁珠qPCR方法进行重复性试验，每份样品做3次重复，以评价该方法的重复性。1.11免疫磁珠qPCR方法的临床应用用建立的免疫磁珠qPCR方法对田间采集95份病原学样品（棉拭子）进行检测，与常规qPCR方法［11］的实验结果相比较，按照符合率的计算公式得出的结果，以评价该方法的临床应用价值。2结果2.1布鲁氏菌单克隆抗体纯化选取流穿液样品、洗涤液样品和洗脱液样品进行SDS-PAGE鉴定纯化效果，其结果纯化后基本上无杂蛋白，布鲁氏菌单克隆抗体得到较好的纯化（见图1）。2.2免疫磁珠qPCR方法的特异性检测免疫磁珠qPCR方法对M5疫苗、A19疫苗和S2疫苗检测结果为阳性，说明该方法可用于多
中国兽医科学第50卷图2免疫磁珠qPCR方法的特异性检测Figure2SpecificresultsofimmunomagneticbeadqPCRmethodS1：M5疫苗；S2：A19疫苗；S3：S2疫苗；S4：大肠杆菌；S5：小肠耶尔森氏菌；S6：金黄色葡萄球菌；S7：沙门菌。S1：M5vaccine；S2：A19vaccine；S3：S2vaccine；S4：E.coli；S5：Y.ente-rocolitica；S6：S.aureus；S7：Salmonel.图3免疫磁珠qPCR方法的敏感性检测Figure3SensitivitytestofimmunomagneticbeadqPCRmethod图1布鲁氏菌单克隆抗体纯化的SDS-PAGE分析Figure1SDS-PAGEanalysisofBrucellamonoclonalanti-bodypurificationM：蛋白分子质量Marker；1～2：流穿液；3～5：洗涤液；6～8：纯化后布鲁氏菌单克隆抗体。M：ProteinmolecularweightMarker；1—2：Flowthroughsolution；3—5：Washingsolution；6—8：PurifiedBrucellamonoclonalantibody.次和3个不同批次的免疫磁珠qPCR方法进行重复性试验，每份样品做3次重复，以评价该方法的重复性。1.11免疫磁珠qPCR方法的临床应用用建立的免疫磁珠qPCR方法对田间采集95份病原学样品（棉拭子）进行检测，与常规qPCR方法［11］的实验结果相比较，按照符合率的计算公式得出的结果，以评价该方法的临床应用价值。2结果2.1布鲁氏菌单克隆抗体纯化选取流穿液样品、洗涤液样品和洗脱液样品进行SDS-PAGE鉴定纯化效果，其结果纯化后基本上无杂蛋白，布鲁氏菌单克隆抗体得到较好的纯化（见图1）。2.2免疫磁珠qPCR方法的特异性检测免疫磁珠qPCR方法对M5疫苗、A19疫苗和S2疫苗检测结果为阳性，说明该方法可用于多
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于重组IBDV VP3蛋白的免疫磁珠间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用[J]. 龚如月,于淑媛,王书博,姜艳平,崔文,乔薪瑗,王丽,周晗,徐义刚,李一经,唐丽杰. 中国兽医科学. 2019(06)
[2]胶体金免疫层析技术在羊布鲁氏菌病的检测应用[J]. 杨旭欣,于守鸿,马丽,谢辉,张爱萍,赵元博,李积权,徐立青. 中国人兽共患病学报. 2018(10)
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[4]牛肉和牛奶中布氏杆菌免疫磁珠富集方法的建立[J]. 易梅芳,欧瑜,唐泰山,赵林立,蒋原,张常印. 药物生物技术. 2014(06)
[5]免疫磁捕获-实时荧光PCR快速检测鸡肉中沙门氏菌[J]. 张东方,袁飞,王娉,胡玥,陈颖,葛毅强. 食品与发酵工业. 2011(08)
硕士论文
[1]基于免疫磁珠—PCR的单增李斯特菌检测方法的建立及p60单链抗体的制备[D]. 韩笑.山东农业大学 2018
[2]基于免疫磁珠与环介导等温扩增的牛奶中金黄色葡萄球菌检测方法的建立[D]. 许会会.吉林大学 2011
本文编号：3229296
【文章来源】：中国兽医科学. 2020,50(10)北大核心CSCD
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【部分图文】：
布鲁氏菌单克隆抗体纯化的SDS-PAGE分析
中国兽医科学第50卷图2免疫磁珠qPCR方法的特异性检测Figure2SpecificresultsofimmunomagneticbeadqPCRmethodS1：M5疫苗；S2：A19疫苗；S3：S2疫苗；S4：大肠杆菌；S5：小肠耶尔森氏菌；S6：金黄色葡萄球菌；S7：沙门菌。S1：M5vaccine；S2：A19vaccine；S3：S2vaccine；S4：E.coli；S5：Y.ente-rocolitica；S6：S.aureus；S7：Salmonel.图3免疫磁珠qPCR方法的敏感性检测Figure3SensitivitytestofimmunomagneticbeadqPCRmethod图1布鲁氏菌单克隆抗体纯化的SDS-PAGE分析Figure1SDS-PAGEanalysisofBrucellamonoclonalanti-bodypurificationM：蛋白分子质量Marker；1～2：流穿液；3～5：洗涤液；6～8：纯化后布鲁氏菌单克隆抗体。M：ProteinmolecularweightMarker；1—2：Flowthroughsolution；3—5：Washingsolution；6—8：PurifiedBrucellamonoclonalantibody.次和3个不同批次的免疫磁珠qPCR方法进行重复性试验，每份样品做3次重复，以评价该方法的重复性。1.11免疫磁珠qPCR方法的临床应用用建立的免疫磁珠qPCR方法对田间采集95份病原学样品（棉拭子）进行检测，与常规qPCR方法［11］的实验结果相比较，按照符合率的计算公式得出的结果，以评价该方法的临床应用价值。2结果2.1布鲁氏菌单克隆抗体纯化选取流穿液样品、洗涤液样品和洗脱液样品进行SDS-PAGE鉴定纯化效果，其结果纯化后基本上无杂蛋白，布鲁氏菌单克隆抗体得到较好的纯化（见图1）。2.2免疫磁珠qPCR方法的特异性检测免疫磁珠qPCR方法对M5疫苗、A19疫苗和S2疫苗检测结果为阳性，说明该方法可用于多
中国兽医科学第50卷图2免疫磁珠qPCR方法的特异性检测Figure2SpecificresultsofimmunomagneticbeadqPCRmethodS1：M5疫苗；S2：A19疫苗；S3：S2疫苗；S4：大肠杆菌；S5：小肠耶尔森氏菌；S6：金黄色葡萄球菌；S7：沙门菌。S1：M5vaccine；S2：A19vaccine；S3：S2vaccine；S4：E.coli；S5：Y.ente-rocolitica；S6：S.aureus；S7：Salmonel.图3免疫磁珠qPCR方法的敏感性检测Figure3SensitivitytestofimmunomagneticbeadqPCRmethod图1布鲁氏菌单克隆抗体纯化的SDS-PAGE分析Figure1SDS-PAGEanalysisofBrucellamonoclonalanti-bodypurificationM：蛋白分子质量Marker；1～2：流穿液；3～5：洗涤液；6～8：纯化后布鲁氏菌单克隆抗体。M：ProteinmolecularweightMarker；1—2：Flowthroughsolution；3—5：Washingsolution；6—8：PurifiedBrucellamonoclonalantibody.次和3个不同批次的免疫磁珠qPCR方法进行重复性试验，每份样品做3次重复，以评价该方法的重复性。1.11免疫磁珠qPCR方法的临床应用用建立的免疫磁珠qPCR方法对田间采集95份病原学样品（棉拭子）进行检测，与常规qPCR方法［11］的实验结果相比较，按照符合率的计算公式得出的结果，以评价该方法的临床应用价值。2结果2.1布鲁氏菌单克隆抗体纯化选取流穿液样品、洗涤液样品和洗脱液样品进行SDS-PAGE鉴定纯化效果，其结果纯化后基本上无杂蛋白，布鲁氏菌单克隆抗体得到较好的纯化（见图1）。2.2免疫磁珠qPCR方法的特异性检测免疫磁珠qPCR方法对M5疫苗、A19疫苗和S2疫苗检测结果为阳性，说明该方法可用于多
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于重组IBDV VP3蛋白的免疫磁珠间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用[J]. 龚如月,于淑媛,王书博,姜艳平,崔文,乔薪瑗,王丽,周晗,徐义刚,李一经,唐丽杰. 中国兽医科学. 2019(06)
[2]胶体金免疫层析技术在羊布鲁氏菌病的检测应用[J]. 杨旭欣,于守鸿,马丽,谢辉,张爱萍,赵元博,李积权,徐立青. 中国人兽共患病学报. 2018(10)
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[5]免疫磁捕获-实时荧光PCR快速检测鸡肉中沙门氏菌[J]. 张东方,袁飞,王娉,胡玥,陈颖,葛毅强. 食品与发酵工业. 2011(08)
硕士论文
[1]基于免疫磁珠—PCR的单增李斯特菌检测方法的建立及p60单链抗体的制备[D]. 韩笑.山东农业大学 2018
[2]基于免疫磁珠与环介导等温扩增的牛奶中金黄色葡萄球菌检测方法的建立[D]. 许会会.吉林大学 2011
本文编号：3229296
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