强、弱毒力新城疫病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

发布时间：2021-06-16 05:59

　　通过比对新城疫病毒强、弱毒株F基因序列,根据其在F0裂解位点的差异以及F基因保守序列设计合成NDV-V-probe和NDV-L-probe探针组和NDV-F、NDV-R引物组,以基因Ⅶ型NA-1株和基因Ⅱ型LaSota疫苗株病毒RNA作为定量检测的标准品,建立检测方法。对所建立的标准曲线进行分析,相关系数R2均为0.997,线性关系良好。通过计算变异系数CV/%分别为0.034%和0.027%,均小于1%,说明稳定性良好。对禽类常见病毒IBV、H9亚型AIV检测未发现有交叉反应,特异性好、重复性佳。结果表明:成功建立了新城疫病毒强、弱毒双重荧光定量RT-PCR的检测方法,实现了从分子水平上快速鉴别强、弱毒力的新城疫病毒,也可快速区分野毒感染动物和疫苗接种动物,减少不必要的经济损失。 

【文章来源】：中国兽医学报. 2017,37(01)北大核心CSCD

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

图１目的基因扩增Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；泳道１～５．强毒株的扩增目的片段；６～９．弱毒株的扩增目的片

２．３标准曲线的确立按２．２优化的反应条件，将标准品１０倍梯度倍比稀释后，分别得到１．０×１０７～１．０１ｃｏｐｉｅｓ／μＬ的标准品模板，以确立的扩增体系进行反应。根据扩增曲线，分别以Ｃｔ为Ｙ轴，标准品浓度的对数值为Ｘ轴绘制标准曲线（图５、６），线性关系分别为ｙ＝－３．３６ｘ＋４１．８５和ｙ＝－３．４３ｘ＋３８．３５，Ｒ２均为０．９９７。线性关系良好。图４ＪＯＥ通道引物浓度的优化１～４．０．２，０．４，０．６，０．８μｍｏｌ／Ｌ；５．阴性对照图５ＮＡ－１株ＲＮＡ标准品标准曲线２．４敏感性试验将ＲＮＡ标准品以１０倍梯度倍比稀释，分别得到１．０×１０７～１．０１ｃｏｐｉｅｓ／μＬ的标准品；荧光定量ＰＣＲ扩增结果图见图７和图８，最低图６ＬａＳｏｔａ株ＲＮＡ标准品标准曲线检测浓度分别为１．０×１０２ｃｏｐｉｅｓ／μＬ和１．０×１０１ｃｏｐｉｅｓ／μＬ。图７ＦＡＭ通道敏感性试验１～８．１．０×１０７～１．０１ｃｏｐｉｅｓ／μＬ；９．阴性对照４中国兽医学报２０１７年１月第３７卷第１期ＣｈｉｎＪＶｅｔＳｃｉＪａｎ．２０１７Ｖｏｌ．３７Ｎｏ．１

２．３标准曲线的确立按２．２优化的反应条件，将标准品１０倍梯度倍比稀释后，分别得到１．０×１０７～１．０１ｃｏｐｉｅｓ／μＬ的标准品模板，以确立的扩增体系进行反应。根据扩增曲线，分别以Ｃｔ为Ｙ轴，标准品浓度的对数值为Ｘ轴绘制标准曲线（图５、６），线性关系分别为ｙ＝－３．３６ｘ＋４１．８５和ｙ＝－３．４３ｘ＋３８．３５，Ｒ２均为０．９９７。线性关系良好。图４ＪＯＥ通道引物浓度的优化１～４．０．２，０．４，０．６，０．８μｍｏｌ／Ｌ；５．阴性对照图５ＮＡ－１株ＲＮＡ标准品标准曲线２．４敏感性试验将ＲＮＡ标准品以１０倍梯度倍比稀释，分别得到１．０×１０７～１．０１ｃｏｐｉｅｓ／μＬ的标准品；荧光定量ＰＣＲ扩增结果图见图７和图８，最低图６ＬａＳｏｔａ株ＲＮＡ标准品标准曲线检测浓度分别为１．０×１０２ｃｏｐｉｅｓ／μＬ和１．０×１０１ｃｏｐｉｅｓ／μＬ。图７ＦＡＭ通道敏感性试验１～８．１．０×１０７～１．０１ｃｏｐｉｅｓ／μＬ；９．阴性对照４中国兽医学报２０１７年１月第３７卷第１期ＣｈｉｎＪＶｅｔＳｃｉＪａｎ．２０１７Ｖｏｌ．３７Ｎｏ．１

【参考文献】：
期刊论文
[1]鉴别新城疫强、弱毒一步RT-PCR方法的建立及应用[J]. 明文龙,尹仁福,谢光耀,薛聪,王珂,袁乾亮,丁壮.  中国兽医学报. 2015(07)
[2]新城疫流行病学新特点及鹅新城疫防控策略[J]. 丁壮,尹仁福,薛聪,王建忠,钱晶.  中国兽医学报. 2015(01)
[3]鹅源新城疫病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 尹仁福,刘新鑫,丁壮,刘美,吴昊.  中国兽医科学. 2008(04)
[4]鹅副粘病毒分离株生物学特性的研究[J]. 丁壮,王承宇,向华,潘玉民,于为民,邹啸环.  中国预防兽医学报. 2002(05)
[5]鸡新城疫病毒强弱毒株RT-PCR鉴别诊断方法[J]. 曹殿军,刘培欣,闫丽辉,孙建宏.  中国预防兽医学报. 2000(06)



本文编号：3232510