山羊DIO3基因组织特异性表达及DNA甲基化分析

发布时间：2021-06-17 01:45

　　DI03基因在甲状腺激素代谢过程中发挥着重要的作用,它对胎儿发育、新生儿生长有着非常重要的作用,尤其对哺乳动物大脑的发育起着至关重要的作用。为了进一步理解DI03基因的结构和功能,我们从南江黄羊的心肌中分离鉴定出DI03基因,采用实时荧光定量PCR技术研究南江黄羊在出生后3 d、30 d、60 d、90 d和120 d这5个生长阶段DIO3在不同组织中mRNA水平的表达差异。同时应用原位杂交技术对大脑不同区域的DIO3 mRNA进行了定位分析；此外,采用MassArray甲基化定量检测方法对出生后3d的南江黄羊不同组织DI03基因内部的CpG岛的甲基化状态进行了检测。主要结果如下：（1）克隆得到南江黄羊DI03基因的编码区全序列,长度为906 bp,编码的氨基酸数目为301个；山羊DI03的编码序列与小鼠、大鼠、人、猪、绵羊和牛的序列相似度分别为83.61%、84.37%、88.52%、90.20%、90.95%和97.46%；而DI03的编码氨基酸序列与牛的同源性为98.67%,与小鼠、大鼠、绵羊、人和猪的相似度分别为89.47%、89.80%、92.36%、92.76%和93.11... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1 文献综述
    1.1 DIO3简介
    1.2 DIO3的结构和功能
    1.3 DIO3基因的研究进展
    1.4 DNA甲基化
        1.4.1 DNA甲基化的作用因素
        1.4.2 哺乳动物DNA甲基化的特点
        1.4.3 哺乳动物DNA甲基化主要的生物学作用
        1.4.4 DNA甲基化的检测方法
    1.5 本研究的目的和意义
2 材料和方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 试验动物
        2.1.2 主要仪器与试剂
        2.1.3 常用的生物信息学网站和分析软件
    2.2 试验方法
        2.2.1 总RNA的提取及质量检测
        2.2.2 cDNA的制备
        2.2.3 基因组DNA的提取
        2.2.4 MassArray甲基化检测
    2.3 克隆引物设计
    2.4 DIO3基因的分离及克隆测序
        2.4.1 RT-PCR扩增
        2.4.2 PCR产物的纯化回收
        2.4.3 RT-PCR产物的克隆
    2.5 基因组织特异性表达分析
        2.5.1 荧光定量特异性引物设计
        2.5.2 实时荧光定量PCR
    2.6 DIO3 mRNA局部定位表达分析
        2.6.1 mRNA原位杂交操作步骤
    2.7 甲基化检测
        2.7.1 甲基化引物设计
        2.7.2 基因组DNA的重亚硫酸盐处理
        2.7.3 甲基化PCR扩增
        2.7.4 PCR产物酶切和RNaseA消化
        2.7.5 产物树脂纯化
        2.7.6 甲基化检测
    2.8 统计分析
3 结果与分析
    3.1 总RNA质量检测
    3.2 RT-PCR扩增结果
        3.2.1 山羊DIO3基因测序结果
    3.3 生物信息学分析
        3.3.1 序列分析
        3.3.2 系统进化树的构建
        3.3.3 山羊DIO3蛋白二级结构的预测
        3.3.4 DIO3蛋白3D结构模型预测
    3.4 DIO3 mRNA组织特异性表达分析
        3.4.1 实时荧光定量PCR引物验证
        3.4.2 标准曲线的建立
        3.4.3 荧光定量PCR扩增产物的特异性
        3.4.4 山羊DIO3 mRNA的组织特异性表达差异
        3.4.5 山羊DIO3 mRNA表达的发育性变化
    3.5 DIO3 mRNA在大脑的定位表达分析
    3.6 甲基化定量分析
        3.6.1 基因组DNA的检测
        3.6.2 DIO3基因内CpG岛的预测分析
        3.6.3 甲基化结果检测
4 讨论
    4.1 克隆的cDNA序列分析
    4.2 DIO3蛋白功能和理化特性分析
    4.3 DIO3 mRNA组织特异性表达分析
    4.4 大脑不同区域的定位表达分析
    4.5 不同组织基因组DNA甲基化分析
5 结论
参考文献
致谢
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本文编号：3234208