牛结核分枝杆菌病感染早期分泌性蛋白MPB 70、MPB 83单克隆抗体的制备及应用
发布时间：2021-06-17 07:07
分枝杆菌,经研究证实归为革兰氏阳性抗酸杆菌中的一类,作为常在菌生存于日常生活环境之中。分枝杆菌也可以分成许多种类,其中一类因为有共同的抗原蛋白可构成结核分枝杆菌复合群。大多数分枝杆菌的菌株生长极为缓慢,有些能够引起人和动物结核及结核样疾病。牛结核分枝杆菌特有的早期感染标识性分泌蛋白是MPB 70和MPB 83蛋白,它们主要应用于在菌株的鉴定和疫苗的研究之中。在利用DNAstar7.0软件综合分析牛型结核分枝杆菌早期标识性分泌性蛋白MPB 70和MPB 83抗原基础上,筛选确定了 MPB 70和MPB 83蛋白编码基因主要抗原域,利用重叠延伸PCR技术,构建了 MPB 70和MPB 83串联重组体。将其连接到原核表达载体pGEX-6p-1,进行诱导和表达。研究获得了一种具有抗原性的牛结核分枝杆菌感染早期标识物MPB 70和MPB 83分泌性蛋白的串联抗原,利用DNAstar7.0生物信息软件对牛结核分枝杆菌感染早期标识性分泌性蛋白MPB 70和MPB 83抗原结构区域进行预测,并设计合成克隆引物,构建重组后的载体得到了高效表达,再加上单克隆抗体的顺利制备,检测纯化后重组蛋白的纯度及抗体效...
【文章来源】：内蒙古民族大学内蒙古自治区
【文章页数】：48 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
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【参考文献】：
期刊论文
[1]山东省莱西市奶牛结核病流行率及风险因素分析[J]. 刘爱玲,马清霞,韩雪,沈朝建,康京丽,张毅,王幼明. 中国动物检疫. 2019(02)
[2]奶牛结核病检测方法研究进展[J]. 李颖,周忠良. 中国畜牧兽医文摘. 2018(06)
[3]牛分枝杆菌感染引起牛肺脏脾脏和淋巴结的病理学变化[J]. 王振玲,倪家敏,孙欣,程广宇,刘春法,岳瑞超,王杰,廖轶,周向梅. 中国兽医杂志. 2018(05)
[4]牛分枝杆菌PtpA基因的原核表达及其多克隆抗体的制备[J]. 平晓坤,植广林,宁章勇,赵琰,陈绚姣,梁玉珍,黄勉,李守军,贾坤. 中国兽医科学. 2018(04)
[5]结核分枝杆菌感染与巨噬细胞凋亡的免疫机制研究进展[J]. 师清博,赵明明,王春凤,钱爱东. 中国兽医学报. 2017(09)
[6]牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛辅助蛋白AP1、BP主要抗原域串联表达及其免疫活性鉴定[J]. 布日额,王金良,吴金花,锡林高娃,陈金龙,孙立杰,王华,朝洛蒙. 中国病原生物学杂志. 2017(07)
[7]牛结核病诊断方法的研究进展[J]. 拉措卓玛. 畜禽业. 2017(07)
[8]奶牛乳腺炎无乳链球菌sip、pgk及FbsA基因主要抗原区域的融合表达及抗原性鉴定[J]. 吴金花,布日额,王金良,陈金龙,锡林高娃,孙立杰,王华,杜长智,白文丽. 中国兽医学报. 2017(07)
[9]牛结核病的传播与控制[J]. 张喜悦,孙明军,范伟兴. 中国动物检疫. 2017(07)
[10]奶牛结核病的预防与控制[J]. 袁立岗,柳炜. 新疆畜牧业. 2017(04)
硕士论文
[1]牛分枝杆菌新型鸡尾酒抗原诊断方法的建立及其初步应用[D]. 陈爽.吉林农业大学 2017
[2]牛分枝杆菌主要分泌性蛋白70和脂蛋白83的克隆表达及抗原性研究[D]. 赵海.中国人民解放军军事医学科学院 2010
本文编号：3234725
【文章来源】：内蒙古民族大学内蒙古自治区
【文章页数】：48 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图四双酶切鉴定重组质粒??２５０??１００＋Ｂ??
?内蒙古民族大学硕士学位论文?２１??１２?３?４??ｔ＞ｐ?ｂｐ??２０００＋?Ｊ??ｌ通＿?＾??１０＂ａｒ＾ｉ??图３?ＭＰＢ?７０、ＭＰＢ?８３主要抗原域基因Ｏｖｅｒ－ＰＣＲ融合结果??Ｆｉｇｕｒｅ?３?Ｏｖｅｒ－ＰＣＲ?ｆｕｓｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ＭＰＢ７０?ａｎｄ?ＭＰＢ８３?ｍａｊｏｒ?ａｎｔｉｇｅｎ?ｄｏｍａｉｎ?ｇｅｎｅｓ??１．ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ?２０００；?２．?ＭＰＢ?７０基因抗原区域扩增；３．?ＭＰＢ?８３基因抗原区扩增：４．?ＭＰＢ?７０＋ＭＰＢ?８３融合基??因扩增??３１３?重组原核表达载体构建及鉴定??回收ＭＰＢ?７０＋ＭＰＢ?８３融合基因片段，经ＢａｍＨ?Ｉ、Ｘｈｏ?Ｉ酶切位点定向引入??ｐＧＥＸ－６ｐ－ｌ，经转化、筛选后获得重组表达载体ｐＧＥＸ－６ｐ－ｌ／ＭＰＢ７０＋ＭＰＢ８３，双酶??切重组质粒可见９６６?ｂｐ和４９６６?ｂｐ两条带（图４），重组质粒经测序结果表明ＭＰＢ??７０＋ＭＰＢ?８３融合基因无碱基突变和缺失（图５），重组载体构建成功。??１２?３?４??ｂｐ?ｂｐ??７５０??５００－＞Ｅ??２５０??１００＋Ｂ??图四双酶切鉴定重组质粒??Ｆｉｇｕｒｅ?４?Ｄｏｕｂｌｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｔｏ?ｉｄｅｎｔｉｆｙ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ??１．ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ?２０００；?２－３．?ｐＧＥＸ－６Ｐ－１／ＭＰＢ?７０＋ＭＰＢ?８３?质粒双酶切结果；４．?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ?１５０００??
感受态细胞，经终浓??度为１．０?ｍＭ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导表达５?ｈ后，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示，在约５８?ｋｕ处出??现目的条带，可溶性鉴定显示，目的蛋白上清和沉淀中均有表达产物存在，破碎后??菌体上清经ＧＳＴ－Ｔｒａｐ填料亲和层析纯化后，ＢＣＡ法测定蛋白浓度为１．２?ｍｇ／ｍ?Ｌ，??表达目的融合蛋白可被ＧＳＴ标签单克隆抗体所识别，表明目的基因获得有效表（图??６）?〇??ｋｕ?Ｍ?１?２?３?４?５?６??－?－?？？?—??２５?？??ｉｓ??１４隹??图６?重组蛋白表达及Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ鉴定??Ｆｉｇｕｒｅ?６?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ａｎｄ?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ??Ｍ：蛋白Ｍａｒｋｅｒ；?１：未诱导重组菌；２：诱导后重组菌；３：诱导后菌体上清；４：诱导后菌体沉淀；５：纯化后??融合蛋白??Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｓｔａｎｄａｒｄ?（１４？１１６?ｋｕ）?；?１．Ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ?ｐＧＥＸ－６ｐ－１／ＭＰＢ７０＋ＭＰＢ８３；?２．?Ｉｎｄｕｃｅｄ??ｐＧＥＸ－６ｐ－１／ＭＰＢ７０＋ＭＰＢ８３；?３．?Ｌｙｓｉｓ?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ；?４．?Ｌｙｓｉｓ?ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；?５．?ｆｕｓｉｏｎ?ｐｒｏｔｅｉｎ；?６．ｐｕｆｉｅｄ?ｆｕｓｉｏｎ??ｐｒｏｔｅｉｎ?ｉｎｔｅｒａｃｔ?ｗｉｔｈ?ＧＳＴ?ｌａｂｅＩ?Ｉ?ｉｎｇ?ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ??
【参考文献】：
期刊论文
[1]山东省莱西市奶牛结核病流行率及风险因素分析[J]. 刘爱玲,马清霞,韩雪,沈朝建,康京丽,张毅,王幼明. 中国动物检疫. 2019(02)
[2]奶牛结核病检测方法研究进展[J]. 李颖,周忠良. 中国畜牧兽医文摘. 2018(06)
[3]牛分枝杆菌感染引起牛肺脏脾脏和淋巴结的病理学变化[J]. 王振玲,倪家敏,孙欣,程广宇,刘春法,岳瑞超,王杰,廖轶,周向梅. 中国兽医杂志. 2018(05)
[4]牛分枝杆菌PtpA基因的原核表达及其多克隆抗体的制备[J]. 平晓坤,植广林,宁章勇,赵琰,陈绚姣,梁玉珍,黄勉,李守军,贾坤. 中国兽医科学. 2018(04)
[5]结核分枝杆菌感染与巨噬细胞凋亡的免疫机制研究进展[J]. 师清博,赵明明,王春凤,钱爱东. 中国兽医学报. 2017(09)
[6]牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛辅助蛋白AP1、BP主要抗原域串联表达及其免疫活性鉴定[J]. 布日额,王金良,吴金花,锡林高娃,陈金龙,孙立杰,王华,朝洛蒙. 中国病原生物学杂志. 2017(07)
[7]牛结核病诊断方法的研究进展[J]. 拉措卓玛. 畜禽业. 2017(07)
[8]奶牛乳腺炎无乳链球菌sip、pgk及FbsA基因主要抗原区域的融合表达及抗原性鉴定[J]. 吴金花,布日额,王金良,陈金龙,锡林高娃,孙立杰,王华,杜长智,白文丽. 中国兽医学报. 2017(07)
[9]牛结核病的传播与控制[J]. 张喜悦,孙明军,范伟兴. 中国动物检疫. 2017(07)
[10]奶牛结核病的预防与控制[J]. 袁立岗,柳炜. 新疆畜牧业. 2017(04)
硕士论文
[1]牛分枝杆菌新型鸡尾酒抗原诊断方法的建立及其初步应用[D]. 陈爽.吉林农业大学 2017
[2]牛分枝杆菌主要分泌性蛋白70和脂蛋白83的克隆表达及抗原性研究[D]. 赵海.中国人民解放军军事医学科学院 2010
本文编号：3234725
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