双荧光标记的伪狂犬病毒gI/gE/TK三基因缺失株的构建和免疫效力研究
发布时间：2021-06-21 09:43
猪伪狂犬病（Pesudorabies virus,PRV）是二类动物疫病,在我国大面积流行,目前主要是用Bartha K61株相关疫苗进行预防免疫。但越来越多的报道指出该疫苗免疫猪场出现PRV发病或猪血清转阳的情况。为解决当前疫情,研发基于本土变异毒株的PRV基因缺失疫苗,进而控制PRV感染态势是当前的主要策略。本试验首先通过改造Puc57质粒,加入TK基因上下游同源臂和红色荧光表达盒,成功构建了可表达红色荧光的含有TK同源臂的Puc57-TK-RED转移载体。随后将实验室已构建的PRV XJ gE/gI双基因缺失株病毒基因组DNA和转移载体质粒DNA共转染细胞,通过同源重组的方法缺失部分TK基因。依靠红色荧光标签,通过空斑实验重复筛选和纯化缺失病毒株。纯化后传代20代,通过特异性gE,gB,TK基因PCR检测纯化病毒株,并结合荧光倒置显微镜下观察的缺失病毒株细胞病变结果,综合判定本次试验成功构建了一株带有绿色荧光和红色荧光标签的PRV XJ gI/gE/TK三基因缺失病毒株。PRV XJ gI/gE/TK三基因缺失株传代稳定性鉴定结果表明,缺失株传代过程稳定,没有外源病毒污染,不会因...
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Puc57质粒图谱
2.3.4 TransIT-X2 Dynamic Delivery System 共转染细胞及同源重组使用核酸蛋白仪测定获得的Puc57-TK-RED质粒和PRV XJ gE/gI双基因缺失株总 DNA 的浓度及纯度。使用 TransIT-X2 Dynamic Delivery System 脂质体转染试剂盒进行 PRV-XJ gE/gI 双基因缺失株 DNA 和 PUC57-TK-RED 质粒DNA 共转染 293T 细胞，具体操作步骤及流程如图 2-2。调节各试剂剂量以不断优化共转染效果，通过同源重组的方式完成 PRV-XJ gE/gI 双基因缺失株 TK基因的缺失，缺失示意图如图 2-3。
图 2-3 缺失构建示意图Fig.2-3 Missing sketch map2.3.5 PRV XJ gI/gE/ TK 三基因缺失株的筛选及纯化对共转染后的细胞进行观察，通过荧光标记筛选缺失成功细胞并进一步纯化，操作步骤如下：1）待共转染的细胞出现病变，并在荧光倒置显微镜下同时发现荧光时，收集该孔细胞液，并进行扩大培养，培养后收集病毒液。2）将病毒液梯度稀释至 10-3-10-7，接种于 12 孔板的 BHK21 细胞，每个稀释梯度接种 2 孔，每孔接种 500μl，每隔 20min 来回摇晃细胞板，4~6h 后弃上清液，并且 PBS 清洗 2~3 次。3）将预热至 42℃的 1.5％无菌低熔点琼脂糖与 2×DMEM 按 1：1 混合，将混合后的营养液铺至每个孔中，置于 4℃静置 20~30min，凝固后置于 37℃、5％CO2
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪伪狂犬病病毒HeN1株全基因组测序及感染和毒力相关基因的变异特征分析[J]. 叶超,赵款,郭金潮,姜成刚,常晓博,王淑杰,王同云,彭金美,蔡雪辉,田志军,安同庆. 中国预防兽医学报. 2015(08)
[2]猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及其gE基因的分子特征[J]. 赵鸿远,彭金美,安同庆,李琳,冷超粮,陈家锃,王倩,常丹,张秋月,蔡雪辉,童光志,田志军. 中国预防兽医学报. 2014(07)
[3]伪狂犬病病毒载体及其应用的研究进展[J]. 何妍萍,贾怀杰,王盈盈,刘太安,景志忠. 中国兽医科学. 2013(10)
[4]我国猪伪狂犬病的最新流行动态与防控措施[J]. 全炎铭. 北方牧业. 2013(12)
[5]伪狂犬病病毒四川株的分离鉴定及增殖特性[J]. 吴云飞,朱玲,徐志文,周远成,魏浩澈,杨雪,郭万柱. 中国兽医科学. 2013(06)
[6]疱疹病毒gI基因及其编码蛋白的研究进展[J]. 李丽娟,程安春,汪铭书. 病毒学报. 2010(04)
[7]PK15、Vero、BHK、CEF细胞增殖猪伪狂犬病病毒的比较[J]. 王岩,杨明凡,崔保安,张素梅,王学斌. 安徽农业科学. 2007(18)
[8]含绿色荧光蛋白基因的伪狂犬病毒Fa株重组猪细小病毒VP2基因表达载体的构建[J]. 罗燕,郭万柱,徐志文,刘艳丽,殷华平,王小玉. 四川农业大学学报. 2005(02)
[9]伪狂犬病基因缺失疫苗株（SA215）生物学特性研究[J]. 陈陆,郭万柱,徐志文,王小玉,王印. 畜牧兽医学报. 2005(03)
[10]伪狂犬病病毒3基因缺失株（SA215）的遗传稳定性研究[J]. 徐志文,郭万柱,朱玲,唐善虎. 畜牧兽医学报. 2004(06)
博士论文
[1]伪狂犬病病毒主要毒力基因功能的研究[D]. 阳爱国.四川农业大学 2005
本文编号：3240450
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Puc57质粒图谱
2.3.4 TransIT-X2 Dynamic Delivery System 共转染细胞及同源重组使用核酸蛋白仪测定获得的Puc57-TK-RED质粒和PRV XJ gE/gI双基因缺失株总 DNA 的浓度及纯度。使用 TransIT-X2 Dynamic Delivery System 脂质体转染试剂盒进行 PRV-XJ gE/gI 双基因缺失株 DNA 和 PUC57-TK-RED 质粒DNA 共转染 293T 细胞，具体操作步骤及流程如图 2-2。调节各试剂剂量以不断优化共转染效果，通过同源重组的方式完成 PRV-XJ gE/gI 双基因缺失株 TK基因的缺失，缺失示意图如图 2-3。
图 2-3 缺失构建示意图Fig.2-3 Missing sketch map2.3.5 PRV XJ gI/gE/ TK 三基因缺失株的筛选及纯化对共转染后的细胞进行观察，通过荧光标记筛选缺失成功细胞并进一步纯化，操作步骤如下：1）待共转染的细胞出现病变，并在荧光倒置显微镜下同时发现荧光时，收集该孔细胞液，并进行扩大培养，培养后收集病毒液。2）将病毒液梯度稀释至 10-3-10-7，接种于 12 孔板的 BHK21 细胞，每个稀释梯度接种 2 孔，每孔接种 500μl，每隔 20min 来回摇晃细胞板，4~6h 后弃上清液，并且 PBS 清洗 2~3 次。3）将预热至 42℃的 1.5％无菌低熔点琼脂糖与 2×DMEM 按 1：1 混合，将混合后的营养液铺至每个孔中，置于 4℃静置 20~30min，凝固后置于 37℃、5％CO2
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪伪狂犬病病毒HeN1株全基因组测序及感染和毒力相关基因的变异特征分析[J]. 叶超,赵款,郭金潮,姜成刚,常晓博,王淑杰,王同云,彭金美,蔡雪辉,田志军,安同庆. 中国预防兽医学报. 2015(08)
[2]猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及其gE基因的分子特征[J]. 赵鸿远,彭金美,安同庆,李琳,冷超粮,陈家锃,王倩,常丹,张秋月,蔡雪辉,童光志,田志军. 中国预防兽医学报. 2014(07)
[3]伪狂犬病病毒载体及其应用的研究进展[J]. 何妍萍,贾怀杰,王盈盈,刘太安,景志忠. 中国兽医科学. 2013(10)
[4]我国猪伪狂犬病的最新流行动态与防控措施[J]. 全炎铭. 北方牧业. 2013(12)
[5]伪狂犬病病毒四川株的分离鉴定及增殖特性[J]. 吴云飞,朱玲,徐志文,周远成,魏浩澈,杨雪,郭万柱. 中国兽医科学. 2013(06)
[6]疱疹病毒gI基因及其编码蛋白的研究进展[J]. 李丽娟,程安春,汪铭书. 病毒学报. 2010(04)
[7]PK15、Vero、BHK、CEF细胞增殖猪伪狂犬病病毒的比较[J]. 王岩,杨明凡,崔保安,张素梅,王学斌. 安徽农业科学. 2007(18)
[8]含绿色荧光蛋白基因的伪狂犬病毒Fa株重组猪细小病毒VP2基因表达载体的构建[J]. 罗燕,郭万柱,徐志文,刘艳丽,殷华平,王小玉. 四川农业大学学报. 2005(02)
[9]伪狂犬病基因缺失疫苗株（SA215）生物学特性研究[J]. 陈陆,郭万柱,徐志文,王小玉,王印. 畜牧兽医学报. 2005(03)
[10]伪狂犬病病毒3基因缺失株（SA215）的遗传稳定性研究[J]. 徐志文,郭万柱,朱玲,唐善虎. 畜牧兽医学报. 2004(06)
博士论文
[1]伪狂犬病病毒主要毒力基因功能的研究[D]. 阳爱国.四川农业大学 2005
本文编号：3240450
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3240450.html
