柔嫩艾美耳球虫4种基因的真核重组质粒构建与EtAMA1核酸疫苗的保护效果初步评价
发布时间：2021-06-22 13:43
球虫病是一种全球性寄生虫病，危害极其严重，它的病原是寄生于细胞内的一种原虫——艾美耳球虫。球虫病可使鸡只增重减少，饲料转化率下降，有较高死亡率，给养鸡业造成巨大的经济损失。据统计，全世界每年大约有超过350亿只鸡受到鸡球虫病的威胁，因球虫病造成的直接经济损失高达5亿英镑。目前鸡球虫病的控制方法主要是使用抗球虫药物进行预防，但是鸡球虫抗药性日益严重，而且人们对食品安全问题越来越关注，所以人们期望找到更为理想的防治球虫病的方法，以减少或者完全替代抗球虫药物的使用。通过疫苗免疫来预防球虫病，将在球虫病防治中发挥越来越重要的作用。核酸疫苗作为第三代疫苗，具有安全、稳定、高效且使用方便的特点，能够同时诱导细胞免疫和体液免疫反应，而且同时表达细胞因子作为免疫佐剂，可以显著增强DNA疫苗的免疫效果，诱导更为广泛和持久的体液免疫和细胞免疫，将是有效控制鸡球虫病的最佳选择。本文选择致病力最为严重的柔嫩艾美耳球虫抗原基因，与真核表达载体pCAGGS连接，制备了核酸疫苗，并对其免疫保护性进行了初步研究，为进一步研究鸡球虫DNA疫苗提供了一定的基础。1．柔嫩艾美耳球虫4种基因（EtAMA1、EtSerpin、...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
DNA疫苗构建的基本特征
图 1.2 DNA 疫苗的作用机理Fig. 1.2 Mechanism of action of DNA vaccine酸疫苗免疫效果的影响因素响核酸疫苗免疫效果的因素有多种：①Kozak 序列。为使真核表达质粒最优化，密码子上游应该有一个 Kozak 序列（GCCA/GCC），这可增强真核基因的翻译效 poly-A 信号序列下游有一个增强子。②接种次数和剂量。一般地，接种次数越多越高；不同动物个体，接种剂量不同：小鼠肌内注射量为 10-100 μg，小动物需要物或人需要 0.5-2.5 mg。但是如果使用基因枪注射，只需要百分之一的量（Dunham过适当的优化，重组质粒可以在体内表达想要的目的抗原蛋白（Dunham，2002；03；Babiuk et al.，2007）。但是，为了诱导有效的免疫应答反应，抗原蛋白需要和保持他们的三级结构。③免疫佐剂。良好的免疫佐剂配合疫苗使用可以增强机，不同的佐剂所产生的免疫效果也不尽相同。已经发现有效的免疫佐剂有 Hsp-7002），细胞因子（Min et al.，2001；Stevenson，2004；Manoj et al.，2004；Dham微粒制剂，配合非离子型阻断共聚物或聚合阳离子（Manoj et al.，2004）等。A 疫苗由于宿主的阻抗、不合适的转染方法和表达水平低等因素使其效果不理想
20 μL 5 min，然后进入以下循环：94℃72℃延伸 10 min，结束后进行电泳段连接到 pGEM-Teasy 载体上，转酶进行酶切鉴定。鉴定为阳性的克结果及序列分析一条大小约为 1400 bp 的条带，与体连接，构建的重组质粒 pGEM-Te性（图2.2），阳性菌液测序结果显示，其中三个位点的碱基发生突变，一 151 位氨基酸由 L 变为 P，第 323 ，氨基酸序列有 99%同源性。
【参考文献】：
期刊论文
[1]柔嫩艾美耳球虫真核起始因子3d基因的酵母表达分析[J]. 孔春林,韩红玉,姜连连,王晔,董辉,赵其平,朱顺海,李婷,薛璞,舒凡帆,黄兵. 中国动物传染病学报. 2012(02)
[2]柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白EtRON2基因的克隆及序列分析[J]. 戚南山,孙铭飞,廖申权,吴彩艳,吕敏娜,袁建丰,余劲术,蔡建平,李祥瑞. 动物医学进展. 2011(12)
[3]表达3个外源基因真核表达载体的构建[J]. 张树梅,黄海碧,滕巧泱,闫丽萍,颜丕熙,徐大伟,戴晓光,张旭,呼和巴特尔,李泽君. 中国预防兽医学报. 2011(04)
[4]鸡球虫病活疫苗的研究进展[J]. 李玉剑,岳城,董辉,黄兵. 中国动物传染病学报. 2009(01)
[5]新型免疫佐剂的研究进展[J]. 尹荣兰,李昌,张乃生,杨正涛,冯晓声. 黑龙江畜牧兽医. 2008(03)
[6]鸡白介素的分子生物学和应用研究进展[J]. 徐永莉,王红宁,黄勇,张毅,余协中. 动物医学进展. 2007(06)
[7]表达载体pCAGGS显著增强禽流感DNA疫苗的免疫保护效果[J]. 姜永萍,张洪波,步志高,李呈军,赵有淑,王秀荣,于康震,陈化兰. 中国农业科学. 2006(04)
[8]柔嫩艾美耳球虫BJ株核酸疫苗的构建及其免疫保护效果研究[J]. 吴绍强,蒋金书,刘群,朱引洁. 中国兽医杂志. 2004(09)
[9]肉鸡球虫病和球虫抗药性的调查[J]. 安健,刘月繁,汪明,张永红,王立波,王黎霞. 中国兽医杂志. 2004(06)
博士论文
[1]柔嫩艾美耳球虫DF-1细胞培养体系的建立及EtSerpin，EtAMA1基因功能的初步研究[D]. 姜连连.中国农业科学院 2011
硕士论文
[1]柔嫩艾美耳球虫真核翻译起始因子3d（eIF3d）基因的研究[D]. 孔春林.上海师范大学 2012
[2]五种鸡堆型艾美耳球虫DNA疫苗免疫保护效果比较[D]. 周婷婷.南京农业大学 2008
[3]四种鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗免疫保护效果比较[D]. 李俊.南京农业大学 2006
[4]鸡柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）DNA疫苗pEtK2-IL-2免疫程序、交叉免疫及稳定性研究[D]. 张步彩.南京农业大学 2006
本文编号：3242941
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
DNA疫苗构建的基本特征
图 1.2 DNA 疫苗的作用机理Fig. 1.2 Mechanism of action of DNA vaccine酸疫苗免疫效果的影响因素响核酸疫苗免疫效果的因素有多种：①Kozak 序列。为使真核表达质粒最优化，密码子上游应该有一个 Kozak 序列（GCCA/GCC），这可增强真核基因的翻译效 poly-A 信号序列下游有一个增强子。②接种次数和剂量。一般地，接种次数越多越高；不同动物个体，接种剂量不同：小鼠肌内注射量为 10-100 μg，小动物需要物或人需要 0.5-2.5 mg。但是如果使用基因枪注射，只需要百分之一的量（Dunham过适当的优化，重组质粒可以在体内表达想要的目的抗原蛋白（Dunham，2002；03；Babiuk et al.，2007）。但是，为了诱导有效的免疫应答反应，抗原蛋白需要和保持他们的三级结构。③免疫佐剂。良好的免疫佐剂配合疫苗使用可以增强机，不同的佐剂所产生的免疫效果也不尽相同。已经发现有效的免疫佐剂有 Hsp-7002），细胞因子（Min et al.，2001；Stevenson，2004；Manoj et al.，2004；Dham微粒制剂，配合非离子型阻断共聚物或聚合阳离子（Manoj et al.，2004）等。A 疫苗由于宿主的阻抗、不合适的转染方法和表达水平低等因素使其效果不理想
20 μL 5 min，然后进入以下循环：94℃72℃延伸 10 min，结束后进行电泳段连接到 pGEM-Teasy 载体上，转酶进行酶切鉴定。鉴定为阳性的克结果及序列分析一条大小约为 1400 bp 的条带，与体连接，构建的重组质粒 pGEM-Te性（图2.2），阳性菌液测序结果显示，其中三个位点的碱基发生突变，一 151 位氨基酸由 L 变为 P，第 323 ，氨基酸序列有 99%同源性。
【参考文献】：
期刊论文
[1]柔嫩艾美耳球虫真核起始因子3d基因的酵母表达分析[J]. 孔春林,韩红玉,姜连连,王晔,董辉,赵其平,朱顺海,李婷,薛璞,舒凡帆,黄兵. 中国动物传染病学报. 2012(02)
[2]柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白EtRON2基因的克隆及序列分析[J]. 戚南山,孙铭飞,廖申权,吴彩艳,吕敏娜,袁建丰,余劲术,蔡建平,李祥瑞. 动物医学进展. 2011(12)
[3]表达3个外源基因真核表达载体的构建[J]. 张树梅,黄海碧,滕巧泱,闫丽萍,颜丕熙,徐大伟,戴晓光,张旭,呼和巴特尔,李泽君. 中国预防兽医学报. 2011(04)
[4]鸡球虫病活疫苗的研究进展[J]. 李玉剑,岳城,董辉,黄兵. 中国动物传染病学报. 2009(01)
[5]新型免疫佐剂的研究进展[J]. 尹荣兰,李昌,张乃生,杨正涛,冯晓声. 黑龙江畜牧兽医. 2008(03)
[6]鸡白介素的分子生物学和应用研究进展[J]. 徐永莉,王红宁,黄勇,张毅,余协中. 动物医学进展. 2007(06)
[7]表达载体pCAGGS显著增强禽流感DNA疫苗的免疫保护效果[J]. 姜永萍,张洪波,步志高,李呈军,赵有淑,王秀荣,于康震,陈化兰. 中国农业科学. 2006(04)
[8]柔嫩艾美耳球虫BJ株核酸疫苗的构建及其免疫保护效果研究[J]. 吴绍强,蒋金书,刘群,朱引洁. 中国兽医杂志. 2004(09)
[9]肉鸡球虫病和球虫抗药性的调查[J]. 安健,刘月繁,汪明,张永红,王立波,王黎霞. 中国兽医杂志. 2004(06)
博士论文
[1]柔嫩艾美耳球虫DF-1细胞培养体系的建立及EtSerpin，EtAMA1基因功能的初步研究[D]. 姜连连.中国农业科学院 2011
硕士论文
[1]柔嫩艾美耳球虫真核翻译起始因子3d（eIF3d）基因的研究[D]. 孔春林.上海师范大学 2012
[2]五种鸡堆型艾美耳球虫DNA疫苗免疫保护效果比较[D]. 周婷婷.南京农业大学 2008
[3]四种鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗免疫保护效果比较[D]. 李俊.南京农业大学 2006
[4]鸡柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）DNA疫苗pEtK2-IL-2免疫程序、交叉免疫及稳定性研究[D]. 张步彩.南京农业大学 2006
本文编号：3242941
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