牛布鲁氏菌毒力基因VirB5间接ELISA检测方法的建立及应用

发布时间：2017-04-24 23:01

  本文关键词：牛布鲁氏菌毒力基因VirB5间接ELISA检测方法的建立及应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人畜共患传染病,其特征是生殖器官和胎膜发炎,引起流产、不育和各种组织的局部病灶。该病给畜牧业和人类的健康带来严重危害。为了建立一种快速准确的检测布鲁氏菌病抗体的ELISA方法。首先对布鲁氏菌病四种血清学检测方法进行比较分析,实验结果如下:RBPT与ELISA,SAT与CFT检测方法的符合率高达到95%以上,且Kappa值均大于0.75。以CFT作为判定标准,RBPT和ELISA敏感性较好,但有假阳性,SAT的特异性较好,但有假阴性。综合比较ELISA的敏感性和特异性都比较理想。选择布鲁氏菌四型分泌系统致病力因子VirB5作为候选基因,在GenBank中获取基因序列,设计引物,以牛种布鲁氏菌疫苗A19全基因序列为模板,扩增得到目的基因,经过BamHI和HindIII双酶切,与pET32a(+)载体链接,得到重组质粒pET32a(+)-VirB5,经测序正确后,转化入大肠杆菌BL21中,诱导表达包涵体蛋白pET32a(+)-VirB5。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,采用Ni柱纯化目的蛋白,Western blot鉴定其活性。将纯化好的重组蛋白作为包被抗原,确定其最佳包被浓度、包被条件、二抗稀释度以及阴阳临界值,初步建立了间接ELISA(VirB5)的检测方法。用该方法对上述294份牛血清样本进行检测,并与RBPT和IDEXX的牛布鲁氏菌间接ELISA试剂盒进行比较,实验结果如下:本实验建立的间接ELISA(VirB5)方法与RBPT比较敏感性、特异性和符合率分别为91.30%、89.60%和90.14%,IDEXX的牛布鲁氏菌间接ELISA试剂盒比较敏感性、特异性和符合率95.45%、94.17%和94.55%。综上所述,布鲁氏菌病的检测可以首先使用ELISA方法进行初筛,然后通过CFT进行确诊,两种血清学检测方法联合诊断结果较为理想。本实验建立的重组蛋白Vir B5间接ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和符合率,可以用于临床布鲁氏菌病血清抗体的检测。
【关键词】：布鲁氏菌 血清学检测 原核表达 重组蛋白VirB5 间接ELISA
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 引用缩写符号说明10-11
• 第一章 文献综述11-21
• 1.1 布鲁氏菌病概述11-12
• 1.2 布鲁氏菌病的危害12-13
• 1.3 布鲁氏菌病原学13
• 1.4 布鲁氏菌病的诊断13-18
• 1.4.1 病原学检测14-18
• 1.4.2 存在的问题及发展方向18
• 1.5 IV型分泌系统的研究进展18-19
• 1.6 本研究的目的与意义19-21
• 第二章 牛布鲁氏菌四种血清学检测方法的比较分析21-33
• 2.1 材料21-22
• 2.1.1 血清样品21
• 2.1.2 主要试剂21
• 2.1.3 主要仪器耗材21-22
• 2.1.4 主要溶液配制22
• 2.2 方法22-28
• 2.2.1 RBPT22-23
• 2.2.2 试管凝集实验23-24
• 2.2.3 酶联免疫吸附实验24-26
• 2.2.4 补体结合实验26-27
• 2.2.5 Kappa值的计算27-28
• 2.3 结果28-30
• 2.3.1 四种血清学检测阳性率结果28
• 2.3.2 RBPT与ELISA检测结果比较28-29
• 2.3.3 SAT与CFT检测结果比较29
• 2.3.4 四种检测方法相关性比较29-30
• 2.4 讨论30-31
• 2.5 小结31-33
• 第三章 牛布鲁氏菌VirB5蛋白原核表达和鉴定33-49
• 3.1 材料33-35
• 3.1.1 菌株、质粒和血清33-34
• 3.1.2 工具酶和主要试剂34
• 3.1.3 主要仪器耗材34
• 3.1.4 主要溶液配制34-35
• 3.2 方法35-43
• 3.2.1 引物的设计与合成35
• 3.2.2 布鲁氏菌DNA的提取35-36
• 3.2.3 VirB5基因的扩增36
• 3.2.4 PCR产物的回收36-37
• 3.2.5 重组质粒pET32a(+)-VirB5的构建37-40
• 3.2.6 目的蛋白的诱导表达40
• 3.2.7 SDS-PAGE电泳40-41
• 3.2.8 蛋白样品超声破碎41-42
• 3.2.9 重组蛋白pET32a(+)-VirB5的纯化42-43
• 3.2.10 重组蛋白的Western blot43
• 3.3 结果43-46
• 3.3.1 VirB5基因PCR扩增结果43-44
• 3.3.2 pET32a(+)-VirB5重组质粒的构建及鉴定44-45
• 3.3.3 重组蛋白VirB5的表达及纯化45
• 3.3.4 表达蛋白的纯化45
• 3.3.5 重组蛋白Western blot鉴定结果45-46
• 3.4 讨论46-49
• 第四章 间接ELISA检测方法的建立与应用49-61
• 4.1 材料49-50
• 4.1.1 主要试剂49
• 4.1.2 抗原49
• 4.1.3 血清49
• 4.1.4 主要试剂制备49-50
• 4.2 方法50-52
• 4.2.1 重组抗原间接ELISA方法的建立50-51
• 4.2.2 临界值的确定51
• 4.2.3 特异性实验51
• 4.2.4 敏感性实验51-52
• 4.2.5 重复性实验52
• 4.2.6 对比实验52
• 4.3 结果52-58
• 4.3.1 最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定52-53
• 4.3.2 间接ELISA最佳工作条件的确定53-58
• 4.4 讨论58-61
• 第五章 全文结论61-63
• 参考文献63-69
• 附录69-75
• 致谢75-77
• 作者简历77

【参考文献】

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本文编号：325106