犬新孢子虫速殖子microRNA的鉴定与分析

发布时间：2017-04-25 02:24

  本文关键词：犬新孢子虫速殖子microRNA的鉴定与分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：犬新孢子虫(Neospora caninum,N.caninum)是一种专性细胞内寄生的顶复门原虫,呈世界性分布。犬新孢子虫对牲畜的危害特别严重,它不仅能够引起包括牛、羊、犬、马、狐狸、白尾鹿等多种孕畜出现流产、产死胎、弱胎和木乃伊胎等严重的繁殖障碍性疾病,并且能够导致刚刚出生的幼畜运动神经系统紊乱,对养殖业造成极大的经济损失。micro RNA(mi RNA)是非编码小RNA家族中十分重要的一类分子,由21-25个核苷酸构成,不能编码蛋白合成,通过诱导产生RNA干扰(RNA interference,RNAi)机制,从而发挥对多种基因表达的调控作用。目前的研究表明mi RNA不仅具有组织特异性,还呈现时序性表达。揭示了mi RNA在多种生命活动的调控过程中担当着十分重要的角色。mi RNA目前已经在多种动植物中被发现,在寄生虫的多个物种中也已经发现了大量的mi RNA,然而对新孢子虫mi RNA的相关研究至今尚无报道,通过对犬新孢子虫mi RNA的种类及其表达情况的探究,将为新孢子虫相关蛋白质功能的研究提供有效工具。本研究选用犬新孢子虫速殖子时期为研究对象,通过高通量测序Solexa技术构建了速殖子时期的小RNA文库并对其进行分析。在拷贝数统计中,两个生物学重复样本共得到了55180517个s RNAs,其中两个样本间共有的s RNAs为53160938个,占总量的96.34%。对测序原始结果进行初步分析,两个样本分别得到了28575212和34778655条高质量序列(High-quality Reads),其中干净序列(Clean Reads)分别有25678775和29501742条,各占测序总量的89.86%和84.43%。非冗余序列(Unique Reads)分别有1125933和954987条,各占测序总量的4.38%和3.24%。将得到的干净序列与犬新孢子虫已知的基因组进行比对分析,两个生物学重复分别有5889027(22.93%)和13412613(45.46%)个Reads能够成功匹配到N.caninum参考基因组上,其中分别有4622636(78.50%)和10510023(78.36%)个Reads为单位置比对(Unique mapped),而1266391(21.50%)和2902590(21.64%)个Reads为多位点匹配(Multiple mapped)。然后对比对到参考基因组上的所有Reads进行分布情况统计,结果显示Reads主要分布在基因间区,其次是分布在非编码外显子区、CDS和内含子。在基因组定位分析结果显示测序Reads广泛分布于犬新孢子虫的14条染色体上,其中Ia号染色体上分布最多,IV号染色体上最少,不同染色体间分布差异较大。对犬新孢子虫的小RNA长度进行分析,结果显示所预测的小RNA序列的长度主要分布在18-30 nt之间,尤其集中在18-22 nt。通过高通量测序技术和生物信息学方法,本课题成功鉴定了10个分属于不同家族的与其他物种同源的保守mi RNA和290个犬新孢子虫特异性mi RNA,其中有66个mi RNA来源于两条臂,剩余的mi RNA来源于一条臂。最后利用q RT-PCR技术,以SYBR Green为荧光染料对其中13个mi RNA的表达规律进行PCR验证,荧光定量结果与Solexa测序结果基本保持一致,表明了高通量测序数据的真实性和可靠性。本研究在高通量测序技术的基础上结合生物信息学相关技术对犬新孢子虫速殖子时期的mi RNA种类及其表达谱进行了测定与分析,将为新孢子虫基因调控机制的研究奠定基础。
【关键词】：犬新孢子虫 速殖子 Solexa测序 microRNA qRT-PCR
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.723
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文缩写词表10-11
• 引言11-13
• 第一篇 文献综述13-29
• 第1章 新孢子虫概述13-17
• 1.1 犬新孢子虫生活史13-14
• 1.2 犬新孢子虫对细胞的侵入机制14
• 1.3 宿主的免疫反应研究14-15
• 1.4 结语15-17
• 第2章 非编码小RNA及MICRORNA研究进展17-29
• 2.1 非编码小RNA与基因沉默17-19
• 2.2 miRNAs的生物发生和作用机制19-22
• 2.3 寄生虫miRNA的研究现状22-28
• 2.4 结语28-29
• 第二篇 研究内容29-79
• 第1章 犬新孢子虫速殖子的体外培养与纯化及小RNA文库的构建与测序29-47
• 1.1 材料29-31
• 1.2 方法31-37
• 1.3 结果37-44
• 1.4 讨论44-46
• 1.5 小结46-47
• 第2章 犬新孢子虫速殖子时期MIRNA的发现与鉴定47-79
• 2.1 材料47-48
• 2.2 方法48-52
• 2.3 结果52-76
• 2.4 讨论76-78
• 2.5 小结78-79
• 结论79-80
• 参考文献80-89
• 攻读硕士期间发表的论文89-90
• 导师简介90-91
• 作者简介91-92
• 致谢92

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