TALEN介导的转人血清白蛋白（HSA）基因山羊克隆胚的制备

发布时间：2017-04-25 06:08

  本文关键词：TALEN介导的转人血清白蛋白（HSA）基因山羊克隆胚的制备，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人血清白蛋白(HSA)是血浆中含量最丰富的蛋白质之一,具有重要的生物医药价值。传统的生产方式主要来源于血浆分离,但是具有传播疾病和供应不稳定的缺点。利用乳腺生物反应器,使外源蛋白基因特异性的在乳腺中表达,并通过乳汁分泌出来,已成为安全稳定的生产稀缺蛋白的重要手段。由于TALEN介导的基因编辑技术能够将外源基因定点插入基因组中,相比于随机整合具有诸多优势,同时利用转基因细胞,通过体细胞核移植是当前生产转基因动物的常规手段。基于此,我们开展了如下工作:1.使用本实验室保存的定点打靶在山羊基因组β-乳球蛋白第一外显子的TALEN质粒对,构建了相应的具有双标记活性的HSA打靶载体pgB-HSA-puro(+);2.通过组织块法进行山羊乳腺上皮细胞的原代培养,使用角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行鉴定。随后将打靶载体pgB-HSA-puro(+)、TALEN质粒对共转山羊乳腺上皮细胞,使用含有1 000 ng/mL puro的细胞培养液筛选到了阳性克隆,并通过激素诱导在阳性乳腺上皮细胞中验证了内源性BLG启动子对HSA表达调控的有效性;3.通过含有1 000 ng/mL puro的细胞培养液将打靶载体pgB-HSA-puro(+)、TALEN质粒对共转山羊胎儿成纤维细胞进行筛选,获得了胎儿成纤维细胞的阳性克隆,以其作为供体细胞,利用体细胞核移植获得了转HSA的克隆囊胚。最终,成功的构建定点打靶山羊β-乳球蛋白第一外显子的HSA打靶载体pgB-HSA-puro(+);并筛选到了TALEN介导的转HSA基因的山羊成纤维细胞克隆,克隆打靶效率可达11%;为相关转基因研究提供了细胞新材料;通过体细胞核移植,获得了克隆囊胚,囊胚发育率可达20.8%。本试验验证了利用山羊乳腺生物反应器生产HAS蛋白的可行性,为下一步转HSA基因羊的生产奠定了基础。
【关键词】：人血清白蛋白 TALEN 乳腺上皮细胞 体细胞核移植 山羊
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827
【目录】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-12
• 文献综述12-26
• 第一章 人血清白蛋白的研究进展12-17
• 1.1 概述12-13
• 1.2 HSA基因13
• 1.3 HAS蛋白13-15
• 1.4 HSA的代谢15
• 1.5 HSA的生物功能15
• 1.6 HSA在生物医药上的应用15-16
• 1.7 展望16-17
• 第二章 TALEN介导的基因编辑17-26
• 2.1 概述17-18
• 2.2 基因编辑技术的发展18
• 2.3 TALEN技术18-20
• 2.3.1 TALE DNA识别编码19
• 2.3.2 TALE的结构19-20
• 2.3.3 TALENs20
• 2.3.4 TALEN体系结构和组装方法20
• 2.4 TALEN的应用20-21
• 2.4.1 在动物中的应用21
• 2.4.2 研究基因功能21
• 2.4.3 应用于大规模的基因组编辑21
• 2.5 影响TALEN效率的因素21-24
• 2.5.1 用于同源重组的供体DNA22
• 2.5.2 TALEN的传递22-23
• 2.5.3 TALEN的传递方法23
• 2.5.4 打靶位点的选择23
• 2.5.5 突变的检测23-24
• 2.5.6 核酸外切酶对NHEJ的加强24
• 2.6 TALEN转录因子的设计24-25
• 2.7 展望25-26
• 实验部分26-54
• 第三章 HSA乳腺打靶载体的构建及功能验证26-45
• 3.1 材料26-27
• 3.1.1 组织26
• 3.1.2 菌株和质粒26
• 3.1.3 主要试剂26-27
• 3.2 HSA打靶载体的构建27-30
• 3.2.1 HSA基因的获得27-29
• 3.2.2 p BA-HSA载体的构建29-30
• 3.2.3 HSA打靶载体pg B-HSA-puro的构建30
• 3.3 pg B-HSA-puro打靶载体的功能验证30-35
• 3.3.1 山羊乳腺上皮细胞的原代培养30
• 3.3.2 山羊乳腺上皮细胞的鉴定30-31
• 3.3.3 puro最佳筛选浓度的确定31
• 3.3.4 乳腺上皮细胞的转染31-32
• 3.3.5 乳腺上皮细胞的筛选32
• 3.3.6 乳腺上皮细胞单克隆的鉴定32-33
• 3.3.7 打靶细胞的诱导33
• 3.3.8 HAS m RNA水平表达的检测33-34
• 3.3.9 HSA蛋白水平的检测34
• 3.3.10 数据统计与分析34-35
• 3.4 结果35-42
• 3.4.1 HSA打靶载体的构建35-37
• 3.4.2 山羊乳腺上皮细胞的原代培养37
• 3.4.3 山羊乳腺上皮细胞的鉴定37-38
• 3.4.4 puro筛选浓度的确定38
• 3.4.5 乳腺上皮细胞的转染和筛选38-39
• 3.4.6 乳腺上皮细胞单克隆的鉴定39-41
• 3.4.7 HSA m RNA水平表达的检测41
• 3.4.8 HSA蛋白水平的检测41-42
• 3.5 讨论42-43
• 3.6 小结43-45
• 第四章 TALEN介导的转HSA山羊重构胚的获得45-54
• 4.1 材料和试剂45-46
• 4.1.1 材料45
• 4.1.2 主要试剂及配制45-46
• 4.2 山羊胎儿成纤维细胞的原代培养46
• 4.3 山羊胎儿成纤维细胞的转染46-47
• 4.4 阳性克隆的筛选和鉴定47
• 4.5 山羊卵母细胞的收集和体外成熟47
• 4.6 体细胞的核移植和胚胎培养47-48
• 4.6.1 供体细胞的准备47
• 4.6.2 卵母细胞的去核和注核47
• 4.6.3 胚胎的激活和培养47-48
• 4.7 数据统计与分析48
• 4.8 结果48-51
• 4.8.1 山羊胎儿成纤维细胞的原代培养48
• 4.8.2 阳性克隆的筛选和鉴定48-50
• 4.8.3 体细胞的核移植和胚胎培养50-51
• 4.9 讨论51-53
• 4.12 小结53-54
• 全文总结54-55
• 参考文献55-64
• 致谢64-65
• 作者简介65

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