Nrf2-ARE信号通路介导的马骨骼肌卫星细胞氧化应激的调控机理
发布时间：2021-06-27 06:01
本试验通过体外分离培养马骨骼肌卫星细胞、鉴定以及氧化应激调控机理的研究,建立了马骨骼肌卫星细胞的培养体系以及氧化应激模型,阐明氧化应激的调控机理,为运动马的骨骼肌氧化应激调控提供科学依据和研究基础。本试验主要分为以下三个部分,试验一体外分离培养蒙古马骨骼肌卫星细胞并对获得的细胞进行鉴定。试验二选取可正常增值,生长状况良好的骨骼肌卫星细胞作为材料,利用H2O2来诱导骨骼肌卫星细胞产生氧化损伤,研究不同浓度的H2O2对骨骼肌卫星细胞的损伤情况,建立起骨骼肌卫星细胞的氧化损伤模型,并筛选出H2O2最佳诱导剂量和作用时间。试验三在建立骨骼肌卫星细胞的正常对照模型和氧化损伤模型的基础上,设计与Nrf2-ARE信号通路相关的基因引物,通过基因的相对表达量以及下游调控的抗氧化基因的表达情况,进而确定Nrf2-ARE信号通路调控蒙古马骨骼肌卫星细胞氧化损伤的机理。本研究得出以下结果:1.试验一:马骨骼肌卫星细胞培养及鉴定选取健康的2岁蒙古马,通过利用胶原酶和含0.25%EDTA的胰酶,两步酶消化法获得骨骼肌卫星细胞,将分离得到的细胞经细胞筛过滤去除直径偏大的杂细胞和细胞碎片,并利用差速贴壁法纯化肌卫星...
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２原代培养的骨骼肌卫星细胞??Ｆｉｇ．２?Ｐｒｉｍａｒｙ?ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ｓｋｅｌｅｔａｌ?ｍｕｓｃｌｅ?ｓａｔｅｌｌｉｔｅ?ｃｅｌｌ??Ａ：１卫Ｂ：３卫Ｃ：５
￡?Ｎｒｆ２－ＡＲＥ信号通路介导的马骨骼肌卫星细胞氧化应激的调控机理???３．１．２明胶对于骨骼肌卫星细胞贴壁速度的影响??醪麗Ｐ：爾??Ｄ?Ｅ?覆＃篆幾＿邊餐輕｜参驗??图３明胶优化肌卫星细胞贴壁速度??Ｆｉｇ．３?Ｇｅｌａｔｉｎ?ｏｐｔｉｍｉｚｅｓ?ｍｕｓｃｌｅ?ｓａｔｅｌｌｉｔｅ?ｃｅｌｌ?ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ?ｓｐｅｅｄ??Ａ：无明胶骨骼肌卫星细胞贴壁ｌｈ；?Ｂ：无明胶骨骼肌卫星细胞４ｈ；?Ｃ：无明胶??骨骼肌卫星细胞８ｈ；?Ｄ：明胶铺层骨骼肌卫星细胞贴壁ｌｈ；?Ｅ：明胶铺层骨骼肌??卫星细胞贴壁４ｈ；?Ｆ：明胶铺层骨骼肌卫星细胞贴壁８ｈ。??ＳＣｓ的贴壁时间较长，贴壁速度缓慢，因此我们通过利用明胶铺层来缩短其??的贴壁时间，以此优化获得蒙古马ＳＣｓ的速度。根据对比有无明胶铺层的细胞??贴壁情况（图６），我们可以发现，无明胶组的细胞在培养ｌｈ后无细胞贴壁（图??Ａ），细胞均漂浮在培养液表面。而有明胶组，大部分细胞同样是漂浮状态，但??是有个别细胞己经开始贴壁（图Ｄ），４ｈ后无明胶组的少量细胞开始贴壁（图Ｂ），??而铺有明胶组细胞贴壁数量更多且贴壁细胞的体积也大于无明胶贴壁组（图Ｅ）。??８ｈ后无明胶组细胞贴壁数量增多，贴壁细胞体积变大（图Ｃ），但是有明胶组??细胞己经开始贴壁生长，并且已经开始延伸，细胞形态也开始发生变化（图Ｆ）。??以上结果表明，有明胶铺层可以增加细胞的贴壁速度，减少细胞的贴壁时间。??３．１．３诱导分化法鉴定骨骼肌卫星细胞??
?内蒙古农业大学硕士学位论文?２３??ＩＨＩ?ＨＨ??图４未分化与分化的肌卫星细胞??Ｆｉｇ．４?Ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ?ａｎｄ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ?ｍｕｓｃｌｅ?ｓａｔｅｌｌｉｔｅ?ｃｅｌｌｓ??Ａ：分化前达到８０％汇合的肌卫星细胞；Ｂ：分化后产生肌管??ＳＣｓ具有可分化为肌管的特点，我们利用ＳＣｓ的这一特点对所分离出的细胞??进行鉴定（图２），通过对正常增殖生长并且汇合率达到７０％－８０％时的ＳＣｓ?（图??Ａ），弃掉皿中的原培养液，清洗一遍后，更换含有２％马血清的的分化培养液??进行诱导分化，通过显微镜观察细胞的形态变化，当更换分化培养液诱导分化后，??ＳＣｓ呈规律性的平行排列，细胞逐渐伸长、变细，增殖的细胞之间发生融合，并??可以观察到肌管的形成（图Ｂ）。对体外培养的牛ＳＣｓ进行诱导分化后发现细胞??进入分化状态，ＳＣｓ融合形成多核肌管，在分化培养的第四天后，细胞形成大量??肌管，并排列成束ｗ］。Ｄｏｄｓｏｎ［６４］在ＤＭＥＭ－１％ＨＳ中培养４天可在体外诱导牛卫??星细胞的最佳分化。研究结果同样表明在培养初期观察到的圆形细胞??正在増殖成肌细胞，而在第５天则观察到多核肌管的形成。这些研宄结果可以证??明分化形成肌管是是ＳＣｓ的一个特点之一，同样证明我们分离出来的骨骼肌卫??星细胞具有良好的体外分化能力。??３．１．４差速贴壁法鉴定马骨骼肌卫星细胞??
【参考文献】：
期刊论文
[1]亚硒酸钠通过Keap1/Nrf2/ARE信号通路诱导人肺腺癌A549细胞凋亡[J]. 田崇梅,夏道宗,邢梦雨,郭璐,张晓熙,赵鑫钰. 中国药理学通报. 2019(02)
[2]矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对H2O2诱导细胞氧化损伤的保护作用[J]. 刘迪,孙宏宇,时文艳,陈为,马爱新,冯宪敏. 食品工业科技. 2019(06)
[3]氧化应激与奶牛肢蹄病关系的研究进展[J]. 王向明,刘宇宸,高景,张轶凤,李晗,李秋爽,齐智利. 中国奶牛. 2018(10)
[4]Dietary resveratrol improves antioxidant status of sows and piglets and regulates antioxidant gene expression in placenta by Keap1-Nrf2 pathway and Sirt1[J]. Qingwei Meng,Tao Guo,Gaoqiang Li,Shishuai Sun,Shiqi He,Baojing Cheng,Baoming Shi,Anshan Shan. Journal of Animal Science and Biotechnology. 2018(03)
[5]地鳖肽对H2O2刺激鸡骨骼肌卫星细胞增殖的影响[J]. 李静怡,徐小艾,晁雨竹,李向东,沈红,张永红. 北京农学院学报. 2019(01)
[6]氧化应激与相关疾病及其作用机制[J]. 云博,吴景东. 沈阳医学院学报. 2018(03)
[7]ROS介导的氧化应激与自噬[J]. 高婷,王子旭,陈祝茗,曹静,董玉兰,董彦君,陈耀星. 中国畜牧兽医. 2018(03)
[8]声动力介导的活性氧与肿瘤关系的研究进展[J]. 宋丹,李冬寒,王丽元,岳琦. 现代肿瘤医学. 2018(06)
[9]氧化应激与结核病[J]. 李春玲,吴康,范小勇. 生命科学. 2017(11)
[10]氧化应激对动物肠道的危害及其营养学缓解措施[J]. 韩月,黄友解,王友明. 上海畜牧兽医通讯. 2017(04)
博士论文
[1]鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞分离培养及生物学特性研究[D]. 边艳超.内蒙古农业大学 2013
[2]大鼠肌卫星细胞体外培养及移植延缓失神经骨骼肌萎缩的实验研究[D]. 陈立.复旦大学 2012
硕士论文
[1]白藜芦醇对FLHS蛋鸡肝脏氧化应激及炎症的调控作用[D]. 叶舒.江西农业大学 2017
本文编号：3252286
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２原代培养的骨骼肌卫星细胞??Ｆｉｇ．２?Ｐｒｉｍａｒｙ?ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ｓｋｅｌｅｔａｌ?ｍｕｓｃｌｅ?ｓａｔｅｌｌｉｔｅ?ｃｅｌｌ??Ａ：１卫Ｂ：３卫Ｃ：５
￡?Ｎｒｆ２－ＡＲＥ信号通路介导的马骨骼肌卫星细胞氧化应激的调控机理???３．１．２明胶对于骨骼肌卫星细胞贴壁速度的影响??醪麗Ｐ：爾??Ｄ?Ｅ?覆＃篆幾＿邊餐輕｜参驗??图３明胶优化肌卫星细胞贴壁速度??Ｆｉｇ．３?Ｇｅｌａｔｉｎ?ｏｐｔｉｍｉｚｅｓ?ｍｕｓｃｌｅ?ｓａｔｅｌｌｉｔｅ?ｃｅｌｌ?ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ?ｓｐｅｅｄ??Ａ：无明胶骨骼肌卫星细胞贴壁ｌｈ；?Ｂ：无明胶骨骼肌卫星细胞４ｈ；?Ｃ：无明胶??骨骼肌卫星细胞８ｈ；?Ｄ：明胶铺层骨骼肌卫星细胞贴壁ｌｈ；?Ｅ：明胶铺层骨骼肌??卫星细胞贴壁４ｈ；?Ｆ：明胶铺层骨骼肌卫星细胞贴壁８ｈ。??ＳＣｓ的贴壁时间较长，贴壁速度缓慢，因此我们通过利用明胶铺层来缩短其??的贴壁时间，以此优化获得蒙古马ＳＣｓ的速度。根据对比有无明胶铺层的细胞??贴壁情况（图６），我们可以发现，无明胶组的细胞在培养ｌｈ后无细胞贴壁（图??Ａ），细胞均漂浮在培养液表面。而有明胶组，大部分细胞同样是漂浮状态，但??是有个别细胞己经开始贴壁（图Ｄ），４ｈ后无明胶组的少量细胞开始贴壁（图Ｂ），??而铺有明胶组细胞贴壁数量更多且贴壁细胞的体积也大于无明胶贴壁组（图Ｅ）。??８ｈ后无明胶组细胞贴壁数量增多，贴壁细胞体积变大（图Ｃ），但是有明胶组??细胞己经开始贴壁生长，并且已经开始延伸，细胞形态也开始发生变化（图Ｆ）。??以上结果表明，有明胶铺层可以增加细胞的贴壁速度，减少细胞的贴壁时间。??３．１．３诱导分化法鉴定骨骼肌卫星细胞??
?内蒙古农业大学硕士学位论文?２３??ＩＨＩ?ＨＨ??图４未分化与分化的肌卫星细胞??Ｆｉｇ．４?Ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ?ａｎｄ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ?ｍｕｓｃｌｅ?ｓａｔｅｌｌｉｔｅ?ｃｅｌｌｓ??Ａ：分化前达到８０％汇合的肌卫星细胞；Ｂ：分化后产生肌管??ＳＣｓ具有可分化为肌管的特点，我们利用ＳＣｓ的这一特点对所分离出的细胞??进行鉴定（图２），通过对正常增殖生长并且汇合率达到７０％－８０％时的ＳＣｓ?（图??Ａ），弃掉皿中的原培养液，清洗一遍后，更换含有２％马血清的的分化培养液??进行诱导分化，通过显微镜观察细胞的形态变化，当更换分化培养液诱导分化后，??ＳＣｓ呈规律性的平行排列，细胞逐渐伸长、变细，增殖的细胞之间发生融合，并??可以观察到肌管的形成（图Ｂ）。对体外培养的牛ＳＣｓ进行诱导分化后发现细胞??进入分化状态，ＳＣｓ融合形成多核肌管，在分化培养的第四天后，细胞形成大量??肌管，并排列成束ｗ］。Ｄｏｄｓｏｎ［６４］在ＤＭＥＭ－１％ＨＳ中培养４天可在体外诱导牛卫??星细胞的最佳分化。研究结果同样表明在培养初期观察到的圆形细胞??正在増殖成肌细胞，而在第５天则观察到多核肌管的形成。这些研宄结果可以证??明分化形成肌管是是ＳＣｓ的一个特点之一，同样证明我们分离出来的骨骼肌卫??星细胞具有良好的体外分化能力。??３．１．４差速贴壁法鉴定马骨骼肌卫星细胞??
【参考文献】：
期刊论文
[1]亚硒酸钠通过Keap1/Nrf2/ARE信号通路诱导人肺腺癌A549细胞凋亡[J]. 田崇梅,夏道宗,邢梦雨,郭璐,张晓熙,赵鑫钰. 中国药理学通报. 2019(02)
[2]矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对H2O2诱导细胞氧化损伤的保护作用[J]. 刘迪,孙宏宇,时文艳,陈为,马爱新,冯宪敏. 食品工业科技. 2019(06)
[3]氧化应激与奶牛肢蹄病关系的研究进展[J]. 王向明,刘宇宸,高景,张轶凤,李晗,李秋爽,齐智利. 中国奶牛. 2018(10)
[4]Dietary resveratrol improves antioxidant status of sows and piglets and regulates antioxidant gene expression in placenta by Keap1-Nrf2 pathway and Sirt1[J]. Qingwei Meng,Tao Guo,Gaoqiang Li,Shishuai Sun,Shiqi He,Baojing Cheng,Baoming Shi,Anshan Shan. Journal of Animal Science and Biotechnology. 2018(03)
[5]地鳖肽对H2O2刺激鸡骨骼肌卫星细胞增殖的影响[J]. 李静怡,徐小艾,晁雨竹,李向东,沈红,张永红. 北京农学院学报. 2019(01)
[6]氧化应激与相关疾病及其作用机制[J]. 云博,吴景东. 沈阳医学院学报. 2018(03)
[7]ROS介导的氧化应激与自噬[J]. 高婷,王子旭,陈祝茗,曹静,董玉兰,董彦君,陈耀星. 中国畜牧兽医. 2018(03)
[8]声动力介导的活性氧与肿瘤关系的研究进展[J]. 宋丹,李冬寒,王丽元,岳琦. 现代肿瘤医学. 2018(06)
[9]氧化应激与结核病[J]. 李春玲,吴康,范小勇. 生命科学. 2017(11)
[10]氧化应激对动物肠道的危害及其营养学缓解措施[J]. 韩月,黄友解,王友明. 上海畜牧兽医通讯. 2017(04)
博士论文
[1]鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞分离培养及生物学特性研究[D]. 边艳超.内蒙古农业大学 2013
[2]大鼠肌卫星细胞体外培养及移植延缓失神经骨骼肌萎缩的实验研究[D]. 陈立.复旦大学 2012
硕士论文
[1]白藜芦醇对FLHS蛋鸡肝脏氧化应激及炎症的调控作用[D]. 叶舒.江西农业大学 2017
本文编号：3252286
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