单增李斯特菌溶源性噬菌体的分离鉴定及部分基因功能研究
发布时间：2021-06-27 17:26
单增李斯特菌（Listeria monocytogenes, LM）是一种重要的人兽共患病原菌,噬菌体是一类专一寄生的细菌病毒,具裂解循环或溶源循环。PCR及其扩增产物的序列测定显示38株单增李斯特菌分离株中的16株在tRNAArg位点携有原噬菌体，利用丝裂霉素C诱导获得一株溶源性噬菌体，透射电子显微镜观察表明该噬菌体为长尾噬菌体，命名为W001，DNaseI、RNaseA和绿豆核酸酶消化噬菌体基因组的结果确认其核酸为dsDNA。鸟枪法测定W001基因组序列，run-off法确认其基因组末端具有COS位点5’-CGGTGTGGGG-3’, W001基因组全长为42，227个碱基，由66个开放阅读框组成，噬菌体整合核心序列attPP’-AATCCCTCTCAGGACG位于噬菌体整合酶下游。第20个开放阅读框编码全长为281个氨基酸的噬菌体裂解酶PLYW001，该酶由NH2端的催化结构域(EnzymaticallyActive Domain，EAD和COOH端的结合结构域（Cell-wall Binding Domain，CBD）组成,利用大肠杆菌表达并制备裂解酶，Ni柱纯化，Bradfo...
【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
噬菌体的裂解循环和溶源循环Fig.1-2Lyticcycleandlysogeniccycleofphage
上海交通大学硕士学位论文- 8 -图1-4 裂解酶结构域Fig.1-4 Domains of endolysin注解：1． Endo-β-N-acetylglucosaminidase(内-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶)2． N-acetylmuramidase (N-乙酰胞壁质酶)3． Endopeptidase(内肽酶)4． N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰氨酶)5． γ-D- glutaminyl-L-lysine endopeptidase (γ-D-谷氨酰胺-L-赖氨酸内肽酶)催化结构域EAD的N-乙酰胞壁质酶（N-acetylmuramidase）和内-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶（Endo-β-N-acetylglucosaminidase）都作用于宿主菌细胞壁半糖上的糖苷键，内肽酶水解肽桥氨基酸之间的肽键，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰氨酶能够水解连接糖链和肽基的酰胺键[35-37]，以此来破坏细菌细胞壁。EAD决定催化活性，CBD决定底物特异性，根据裂解裂结构和功能的不同,可将不同裂解酶的催化域和结合域进行重组替换以构建具有不同功能的裂解酶。Garcia等人重组了肺炎链球菌噬菌体裂解酶Cpl-1，替换了该酶EAD，同时保持CBD不变，产生一种新酶,新旧两种酶裂解不同位点的糖苷键[38]。1.3.2 影响裂解酶裂解效果几个因素无论是源自革兰氏阳性菌的噬菌体还是源自革兰氏阴性菌的噬菌体
上海交通大学硕士学位论文果位点的原噬菌体检测保存的 38 株 LM 分离株进行检测，其中 16 株 PCR 检测阳小与预测一致（图 2-1），说明在这 16 株菌株的 tRNAArg位纯化上述16条PCR产物，以NC16为测序引物进行序列测定oc 软件作多重序列分析（图 2-2），可知 16 条 PCR 产物第 1，为 74 bp 的 tRNAArg基因及其 3’末端的噬菌体整合核TCAGGACG, tRNAArg下游的核苷酸呈现多样性，分析显示其可以确认 PCR 扩增阳性的 16 株分离株的 tRNAArg位点确实
【参考文献】：
期刊论文
[1]细菌耐药性研究进展[J]. 徐海花,牛钟相,秦爱建,张万福. 山东农业大学学报(自然科学版). 2010(01)
本文编号：3253281
【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
噬菌体的裂解循环和溶源循环Fig.1-2Lyticcycleandlysogeniccycleofphage
上海交通大学硕士学位论文- 8 -图1-4 裂解酶结构域Fig.1-4 Domains of endolysin注解：1． Endo-β-N-acetylglucosaminidase(内-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶)2． N-acetylmuramidase (N-乙酰胞壁质酶)3． Endopeptidase(内肽酶)4． N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰氨酶)5． γ-D- glutaminyl-L-lysine endopeptidase (γ-D-谷氨酰胺-L-赖氨酸内肽酶)催化结构域EAD的N-乙酰胞壁质酶（N-acetylmuramidase）和内-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶（Endo-β-N-acetylglucosaminidase）都作用于宿主菌细胞壁半糖上的糖苷键，内肽酶水解肽桥氨基酸之间的肽键，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰氨酶能够水解连接糖链和肽基的酰胺键[35-37]，以此来破坏细菌细胞壁。EAD决定催化活性，CBD决定底物特异性，根据裂解裂结构和功能的不同,可将不同裂解酶的催化域和结合域进行重组替换以构建具有不同功能的裂解酶。Garcia等人重组了肺炎链球菌噬菌体裂解酶Cpl-1，替换了该酶EAD，同时保持CBD不变，产生一种新酶,新旧两种酶裂解不同位点的糖苷键[38]。1.3.2 影响裂解酶裂解效果几个因素无论是源自革兰氏阳性菌的噬菌体还是源自革兰氏阴性菌的噬菌体
上海交通大学硕士学位论文果位点的原噬菌体检测保存的 38 株 LM 分离株进行检测，其中 16 株 PCR 检测阳小与预测一致（图 2-1），说明在这 16 株菌株的 tRNAArg位纯化上述16条PCR产物，以NC16为测序引物进行序列测定oc 软件作多重序列分析（图 2-2），可知 16 条 PCR 产物第 1，为 74 bp 的 tRNAArg基因及其 3’末端的噬菌体整合核TCAGGACG, tRNAArg下游的核苷酸呈现多样性，分析显示其可以确认 PCR 扩增阳性的 16 株分离株的 tRNAArg位点确实
【参考文献】：
期刊论文
[1]细菌耐药性研究进展[J]. 徐海花,牛钟相,秦爱建,张万福. 山东农业大学学报(自然科学版). 2010(01)
本文编号：3253281
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