表达异源优势抗原的转基因球虫激发宿主保护性免疫应答的研究
发布时间：2021-06-30 07:52
疫苗免疫是动物疫病防控最主要策略之一。在动物疫病疫苗研制中,抗原运送载体在抗原发掘以及提升疫苗安全性和有效性中具有重要作用。随着艾美耳属球虫反向遗传操作平台及其激发宿主免疫应答检测系统的建立与不断完善,转基因艾美耳属球虫作为疫苗载体具备了可行性。本研究从抗原因素（主要是抗原的空间位置、表达量、持续时间/方式）和宿主因素（免疫受体-配体和细胞因子）进行优化,进而提升表达异源抗原的转基因球虫激发的免疫保护力,从而为推进艾美耳属球虫作为疫苗载体提供数据支撑。为了研究病原抗原的表达量对转基因球虫激发宿主免疫应答的影响,本研究以增强型黄色荧光蛋白（EYFP）和禽流感病毒M2e抗原为模型,通过调控异源抗原表达的不同元件、P2A介导的单表达框共表达多抗原以及异源抗原多拷贝串联表达等多种策略增强转基因球虫表达异源抗原的量。结果显示,SAG13强启动子显著增强EYFP的表达水平;艾美耳属球虫可高效利用P2A的自我剪切功能实现多异源蛋白的共表达;多拷贝串联的M2e的表达水平显著高于单拷贝表达。进一步地,提升转基因球虫表达异源抗原（EYFP或M2e）的量,其激发宿主产生特异性免疫应答的水平显著提升。结果表明...
【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：122 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图２．?３?２Ａ多肽成功剪切ＥｔＥＲ表达的ＥＹＦＰ和ＲＦＰ??Ａ．?ＥＹＦＰ主要表达于细胞核，ＲＦＰ在胞浆中有表达（ａ－ｆ）
前期研究结果证实启动子的强弱是影响转基因球虫表达异源蛋白水平的关键因素。为了分析??和量化强弱启动子调控蛋白表达水平的差异，建立转基因球虫表达异源蛋白量的检测平台。本研??宄选取ＳＡＧ１３和Ｈｉｓ４启动子调控模式蛋白ＥＹＦＰ表达的稳定转基因球虫株ＥｔＥＲ?（图２．２和图??２．３）和ＥｔＭ２ｅ［２９，５４］为强、弱启动子作用元件的模式虫株分析ＥＹＦＰ的表达水平。在相同观察模式??（激光共聚焦显微镜各调节参数均保持一致）下，ＥｔＭ２ｅ虫株ＥＹＦＰ的荧光强度显著低于ＥｔＥＲ??虫株的荧光强度，前者的平均灰度值仅是后者的１／８?（图２．４?Ａ）。本研究还以ＥＹＦＰ为模式抗原测??定其在转基因球虫可溶性抗原的相对含量进而建立检测转基因球虫表达异源蛋白水平的平台。以??重组ＥＹＦＰ为标准品，ＥＹＦＰ特异性抗体进行免疫印迹，得到目的条带的积分光密度值（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ??Ｏｐｔｉｃａｌ?Ｄｅｎｓｉｔｙ，?ＩＯＤ）与蛋白浓度之间的线性关系（图２．４Ｂ）。同等条件下，相同浓度（５００?ｎｇ／ｐ）??的ＥｔＭ２ｅ和ＥｔＥＲ可溶性抗原检测到的丨ＯＤ值分别为７８８．４２和２１２７．４，经公式（图２．４?Ｂ）推算??出ＥｔＭ２ｅ和ＥｔＥＲ可溶性抗原中ＥＹＦＰ的浓度为１．５８?ｎｇ化丨和４．４６?ｎｇ／ｊｉｌ。所以ＥＹＦＰ占ＥｔＭ２ｅ和??ＥｔＥＲ可溶性抗原的比例分别为３．１６９６〇和８．９２％〇。综上
转基因球虫表达异源蛋白水平的有效策略。本研宄进一步分析髙表达模式抗原ＥＹＦＰ和Ｍ２ｅ的??转基因球虫激发异源抗原特异性免疫应答的强度。ＥＹＦＰ不同表达水平的转基因球虫（ＥｔＥＲ和??ＥｔＭ２ｅ）经口免疫鸡群（图２．６Ａ），于免疫前和免疫后的不同时间点采集血清测定ＥＹＦＰ、ＳＡＧ１３??和球虫全抗原（ＥｔＡｇ）特异性的抗体应答水平。研宄结果显示，二免后ＥＹＦＰ、ＳＡＧＩ３和ＥｔＡｇ的??抗体水平均显著提升，其中ＥｔＥＲ免疫组ＥＹＦＰ抗体水平显著髙于ＥｔＭ２ｅ免疫组，野生型球虫??（ＷＴ）免疫组和对照组不产生ＥＹＦＰ特异性的抗体应答；内源性抗原ＳＡＧ１３和ＥｔＡｇ特异性的??抗体应答无论是转基因球虫还是野生型球虫免疫后均显著提升（图２．６Ｂ）。研宄结果说明，提升??转基因球虫表达ＥＹＦＰ的量可显著增强其激发宿主免疫应答的水平。??Ｍ２ｅ不同拷贝数的转基因球虫（１２拷贝ＥｔｐＭ２ｅ和单拷贝ＥｔＭ２ｅ）经口免疫鸡群（图２．７Ａ），??分析免疫后的卵囊排出和Ｍ２ｅ特异性抗体的水平。结果显示，各球虫免疫组二次免疫后的卵囊排??出显著低于初次免疫后的卵囊排出（图２．７?Ｂ），说明多拷贝高表达异源病毒抗原对球虫的免疫原??性没有影响。经加强免疫后
【参考文献】：
期刊论文
[1]禽流感-火鸡疱疹病毒重组活载体疫苗的研究进展[J]. 郝小利,刘秀梵. 中国家禽. 2015(21)
[2]Salmonella Typhi:from a Human Pathogen to a Vaccine Vector[J]. Victor Tunje Jeza. Cellular & Molecular Immunology. 2008(02)
[3]痘病毒疫苗载体[J]. 庞乐君,刁天喜. 国外医学(药学分册). 2004(03)
博士论文
[1]融合表达IgY/IgG Fc片段和H9N2禽流感病毒HA1转基因艾美耳球虫的构建及免疫原性研究[D]. 秦梅.中国农业大学 2015
本文编号：3257354
【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：122 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图２．?３?２Ａ多肽成功剪切ＥｔＥＲ表达的ＥＹＦＰ和ＲＦＰ??Ａ．?ＥＹＦＰ主要表达于细胞核，ＲＦＰ在胞浆中有表达（ａ－ｆ）
前期研究结果证实启动子的强弱是影响转基因球虫表达异源蛋白水平的关键因素。为了分析??和量化强弱启动子调控蛋白表达水平的差异，建立转基因球虫表达异源蛋白量的检测平台。本研??宄选取ＳＡＧ１３和Ｈｉｓ４启动子调控模式蛋白ＥＹＦＰ表达的稳定转基因球虫株ＥｔＥＲ?（图２．２和图??２．３）和ＥｔＭ２ｅ［２９，５４］为强、弱启动子作用元件的模式虫株分析ＥＹＦＰ的表达水平。在相同观察模式??（激光共聚焦显微镜各调节参数均保持一致）下，ＥｔＭ２ｅ虫株ＥＹＦＰ的荧光强度显著低于ＥｔＥＲ??虫株的荧光强度，前者的平均灰度值仅是后者的１／８?（图２．４?Ａ）。本研究还以ＥＹＦＰ为模式抗原测??定其在转基因球虫可溶性抗原的相对含量进而建立检测转基因球虫表达异源蛋白水平的平台。以??重组ＥＹＦＰ为标准品，ＥＹＦＰ特异性抗体进行免疫印迹，得到目的条带的积分光密度值（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ??Ｏｐｔｉｃａｌ?Ｄｅｎｓｉｔｙ，?ＩＯＤ）与蛋白浓度之间的线性关系（图２．４Ｂ）。同等条件下，相同浓度（５００?ｎｇ／ｐ）??的ＥｔＭ２ｅ和ＥｔＥＲ可溶性抗原检测到的丨ＯＤ值分别为７８８．４２和２１２７．４，经公式（图２．４?Ｂ）推算??出ＥｔＭ２ｅ和ＥｔＥＲ可溶性抗原中ＥＹＦＰ的浓度为１．５８?ｎｇ化丨和４．４６?ｎｇ／ｊｉｌ。所以ＥＹＦＰ占ＥｔＭ２ｅ和??ＥｔＥＲ可溶性抗原的比例分别为３．１６９６〇和８．９２％〇。综上
转基因球虫表达异源蛋白水平的有效策略。本研宄进一步分析髙表达模式抗原ＥＹＦＰ和Ｍ２ｅ的??转基因球虫激发异源抗原特异性免疫应答的强度。ＥＹＦＰ不同表达水平的转基因球虫（ＥｔＥＲ和??ＥｔＭ２ｅ）经口免疫鸡群（图２．６Ａ），于免疫前和免疫后的不同时间点采集血清测定ＥＹＦＰ、ＳＡＧ１３??和球虫全抗原（ＥｔＡｇ）特异性的抗体应答水平。研宄结果显示，二免后ＥＹＦＰ、ＳＡＧＩ３和ＥｔＡｇ的??抗体水平均显著提升，其中ＥｔＥＲ免疫组ＥＹＦＰ抗体水平显著髙于ＥｔＭ２ｅ免疫组，野生型球虫??（ＷＴ）免疫组和对照组不产生ＥＹＦＰ特异性的抗体应答；内源性抗原ＳＡＧ１３和ＥｔＡｇ特异性的??抗体应答无论是转基因球虫还是野生型球虫免疫后均显著提升（图２．６Ｂ）。研宄结果说明，提升??转基因球虫表达ＥＹＦＰ的量可显著增强其激发宿主免疫应答的水平。??Ｍ２ｅ不同拷贝数的转基因球虫（１２拷贝ＥｔｐＭ２ｅ和单拷贝ＥｔＭ２ｅ）经口免疫鸡群（图２．７Ａ），??分析免疫后的卵囊排出和Ｍ２ｅ特异性抗体的水平。结果显示，各球虫免疫组二次免疫后的卵囊排??出显著低于初次免疫后的卵囊排出（图２．７?Ｂ），说明多拷贝高表达异源病毒抗原对球虫的免疫原??性没有影响。经加强免疫后
【参考文献】：
期刊论文
[1]禽流感-火鸡疱疹病毒重组活载体疫苗的研究进展[J]. 郝小利,刘秀梵. 中国家禽. 2015(21)
[2]Salmonella Typhi:from a Human Pathogen to a Vaccine Vector[J]. Victor Tunje Jeza. Cellular & Molecular Immunology. 2008(02)
[3]痘病毒疫苗载体[J]. 庞乐君,刁天喜. 国外医学(药学分册). 2004(03)
博士论文
[1]融合表达IgY/IgG Fc片段和H9N2禽流感病毒HA1转基因艾美耳球虫的构建及免疫原性研究[D]. 秦梅.中国农业大学 2015
本文编号：3257354
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