猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及六个外膜蛋白的免疫原性研究

发布时间：2021-07-08 04:11

　　胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）是属于巴氏杆菌科放线杆菌属的革兰氏阴性球杆菌,能引起猪的传染性胸膜肺炎。该病的临床特征主要表现为肺坏死、出血和胸膜肺炎,具有高度接触传染性和致死性。目前,除了少部分尚未定型的菌株外,APP主要包括15种血清型,预防和控制本病依然主要使用灭活疫苗,由于型之间的交叉保护力不好,导致灭活苗的保护效果十分有限。本试验主要是对胸膜肺炎放线杆菌的omlA、plpA、lolB、omp2、ompAe及plpB六个外膜蛋白进行了克隆及原核表达,并研究了它们的免疫原性。从湖南送检的疑似胸膜肺炎的猪病料中分离到一株APP,并对其做了PCR鉴定、生化试验、药敏试验及动物感染试验,确定该株APP为血清1型。根据GenBank中发表的胸膜肺炎放线杆菌的全基因序列（Accession:CP001091）,利用DNAstar软件挑选出6个外膜蛋白基因设计引物,其中ompAe基因引物中设有BamH Ⅰ和Sal Ⅰ两个酶切位点,其它五个蛋白基因均含有EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ两个酶切位点。以APP全菌为模板对各目的基因进行PCR扩增... 

【文章来源】：湖南农业大学湖南省

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
第一章 文献综述
    1 病原学特性
    2 临床特征及病理变化
    3 主要毒力因子
    4 APP的诊断方法研究
    5 免疫预防
    6 展望
第二章 猪胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定及其对小鼠致病性试验
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 病料来源
            1.1.2 主要培养基
            1.1.3 主要试剂
            1.1.4 试验动物
        1.2 方法
            1.2.1 细菌的分离
            1.2.2 形态学观察
            1.2.3 V因子(NAD)依赖试验
            1.2.4 生化试验
            1.2.5 药敏试验
            1.2.6 PCR鉴定
            1.2.7 序列测定
            1.2.8 动物感染试验
    2 结果与分析
        2.1 细菌分离及培养特性
        2.2 生化试验
        2.3 药敏试验
        2.4 PCR鉴定及序列分析
        2.5 动物感染试验
            2.5.1 临床症状与剖检病理变化
            2.5.2 病原菌的分离及鉴定
    3 讨论
    4 小结
第三章 猪胸膜肺炎放线杆菌lolB、plpA、plpB、omp2、omlA和ompAe基因的克隆表达及其免疫原性分析
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 菌种和载体
            1.1.2 主要试剂
            1.1.3 引物合成
        1.2 方法
            1.2.1 PCR模板的制备
            1.2.2 目的基因的PCR扩增
            1.2.3 融合表达载体的构建及连接产物的转化
            1.2.4 阳性转化子的鉴定及重组质粒的构建与鉴定
            1.2.5 重组蛋白的诱导表达及鉴定
            1.2.6 重组蛋白的大量诱导及纯化
            1.2.7 重组蛋白的Western blot鉴定
            1.2.8 昆明小鼠的免疫试验
    2 结果与分析
        2.1 APP的6个目的基因的扩增、序列分析及酶切鉴定
        2.2 重组蛋白的SDS-PAGE鉴定
        2.3 六个重组蛋白的纯化及Western blot鉴定
        2.4 免疫攻毒保护试验
    3 讨论
    4 小结
第四章 LTB-omp2、LTB-omlA的克隆表达及与omlA及omp2的免疫原性分析
    1 材料和方法
        1.1 材料
        1.2 方法
            1.2.1 PCR扩增
            1.2.2 融合表达载体的构建及鉴定
            1.2.3 融合蛋白的诱导表达、鉴定及纯化
            1.2.4 重组蛋白的主动免疫保护性试验
    2 结果与分析
        2.1 LTB-omp2及LTB-omlA的阳性鉴定、序列测定及分析
        2.2 融合蛋白的SDS-PAGE鉴定
        2.3 昆明小鼠免疫攻毒保护试验
    3 讨论
    4 小结
总结
参考文献
符号说明
致谢
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪胸膜肺炎放线杆菌四川株的分离鉴定及药物敏感性试验[J]. 彭娟,杨泽晓,宋勇,王印.  中国畜牧兽医. 2011(10)
[2]猪传染性胸膜肺炎的流行特点与综合防治[J]. 潘耀荣,谢凯崇,陈正飞.  今日畜牧兽医. 2011(10)
[3]猪传染性胸膜肺炎的研究进展[J]. 王亚军,段艳萍.  兽医导刊. 2008(01)
[4]淄博地区猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 陈凯,杜爱庆,张伟,曲德福,战玉萍.  山东畜牧兽医. 2007(03)
[5]猪传染性胸膜肺炎重组亚单位疫苗保护效果的评价及其免疫机制的研究[J]. 王勇,刘思国,王春来,邵美丽,宫强,刘建东,迟磊,赵昆,郭设平,李广兴.  中国兽医科学. 2006(12)
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[9]猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及自家疫苗的制备[J]. 刘辉,田颖.  畜牧兽医科技信息. 2005(03)
[10]胸膜肺炎放线杆菌生物学特性概述[J]. 张耀相,杨会霞,李健强.  动物医学进展. 2004(06)

硕士论文
[1]胸膜肺炎放线杆菌血清学分型和基因分型的研究[D]. 陈凡.华中农业大学 2004



本文编号：3270833