鸭源呼肠孤病毒致BHK-21细胞凋亡的研究

发布时间：2021-07-09 18:52

　　本试验采用细胞培养术、RT-PCR技术、光镜、电镜、荧光定量RT-PCR、TUNEL和流式细胞术等多种研究方法,对近几年来湖北省鸭源呼肠孤病毒分离株（Duck Reovirus, DRV） JZ061214株、HP080421株、HP081122株、HP09318株和YM101120株感染BHK-21细胞后细胞的病理变化特点、基因结构特点、病毒增殖状况和诱导细胞凋亡情况等作了系统的研究。DRV感染BHK-21细胞的病理变化情况：攻毒后24h,细胞开始出现病变,表现为有的细胞圆缩,溶解、碎裂,攻毒48h后,病变逐渐加重,圆缩细胞越来越多,并可见悬浮的巨细胞,攻毒72h后,大量死亡细胞悬浮于培养液中。细胞经H.E染色,显微镜观察可见：部分细胞死亡,感染细胞核固缩、碎裂,且出现嗜酸性包涵体和合胞体。感染DRV的BHK-21被收集用来制作超薄切片,电镜下可观察到大小不一的空泡,同时,细胞质中呈现晶格状排列的病毒颗粒,病毒在细胞质增殖、复制,通过细胞崩解释放出来。DRV感染BHK-21后的增殖情况：于接种病毒后1-72h七个时间段分别进行收毒,用荧光定量RT-PCR法检测所获病毒含量。结果表明,... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
縮略词表
前言
    1 禽呼肠孤病毒(ARV)病概述
        1.1 呼肠孤病毒病
        1.2 流行病学
            1.2.1 传染源
            1.2.2 传播途径
            1.2.3 易感动物
        1.3 鸡呼肠孤病毒感染
        1.4 鸭呼肠孤病毒感染
    2 禽呼肠孤病毒
        2.1 呼肠孤病毒的形态特点
        2.2 病毒对细胞的致病性
        2.3 病毒的基因组结构
    3 呼肠孤病毒与细胞凋亡
本研究的目的与意义
材料与方法
    1 材料
        1.1 病毒
        1.2 细胞
        1.3 参考序列
        1.4 主要实验耗材
        1.5 主要仪器设备
        1.6 主要溶液及其配制
            1.6.1 细胞生长(营养)液
            1.6.2 细胞维持液
            1.6.3 PBS(0.1M,pH=7.2,无钙镁)配制
            1.6.4 4%中性多聚甲醛
            1.6.5 50×TAE电泳缓冲液
            1.6.6 琼脂糖凝胶
            1.6.7 TBS(0.01M,pH=7.5)配法
            1.6.8 2.5%戊二醛固定液配制
            1.6.9 LB配方
    2 方法
        2.1 BHK-21细胞的传代培养
        2.2 鸭源呼肠孤病毒的接种和增殖
        2.3 鸭源呼肠孤病毒致BHK-21细胞的病变
        2.4 TUNEL法染色检测细胞凋亡
        2.5 鸭源呼肠孤病毒致BHK-21细胞的超微病变及观察
        2.6 实时荧光定量RT-PCR检测DRV感染后BHK-21细胞和其培养液混合物中的病毒含量
        2.7 流式细胞仪对4株DRV攻毒后BHK-21细胞凋亡的检测
        2.8 鸭源呼肠孤病毒S组基因的扩增
        2.9 产物的回收和纯化
        2.10 产物连接和转化
        2.11 菌液PCR鉴定
        2.12 序列分析
    3 数据统计与处理
结果与分析
    1 病毒致BHK-21细胞的病理变化观察
        1.1 倒置显微镜下观察细胞的形态
        1.2 光镜下观察细胞病变
        1.3 鸭源呼肠孤病毒致BHK-21细胞的超微病变
    2 实时荧光定量RT-PCR检测DRV感染后BHK-21细胞和其培养液混合物中的病毒含量
    3 BHK-21细胞感染DRV后,应用流式细胞仪进行细胞凋亡检测结果
    4 BHK-21细胞感染DRV后,应用TUNEL进行细胞凋亡检测的结果
    5 DRV S基因组的扩增结果及序列分析
        5.1 DRV S基因组的扩增
            5.1.1 S2基因的扩增
            5.1.2 S3基因的扩增
            5.1.3 S4基因的扩增
        5.2 DRV S组基因序列分析
            5.2.1 DRV S2基因核苷酸序列遗传进化分析结果
            5.2.2 DRV S3基因核苷酸序列遗传进化分析结果
            5.2.3 DRV S4基因核苷酸序列遗传进化分析结果
讨论
    1 DRV致BHK-21细胞病变特点
    2 各株DRV细胞凋亡与病毒增殖特点
    3 DRV S组基因分析
结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]新型鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定[J]. 陈少莺,陈仕龙,林锋强,王劭,江斌,程晓霞,朱小丽,李兆龙.  病毒学报. 2012(03)
[2]番鸭呼肠孤病毒分子流行病学研究[J]. 林锋强,朱小丽,陈少莺,王劭,陈仕龙,程晓霞,江斌,李兆龙.  福建农业学报. 2012(03)
[3]番鸭呼肠孤病毒YB株σNS基因的克隆和序列分析[J]. 吴异健,王劭,黄一帆,吴宝成.  江西农业大学学报. 2011(01)
[4]鸭源呼肠孤病毒感染引起雏鸭免疫损伤的观察[J]. 李爽,谷长勤,白家媛,张红,张万坡,程国富,胡薛英.  中国农业科学. 2010(21)
[5]两株草鱼呼肠孤病毒江西株的分离与鉴定[J]. 徐洋,郝贵杰,沈锦玉,郑善坚,潘晓艺,姚嘉赟,尹文林.  淡水渔业. 2010(03)
[6]番鸭呼肠孤病毒诱导的细胞凋亡观察[J]. 祁保民,陈晓燕,吴宝成,姚金水,张红雷.  畜牧兽医学报. 2010(04)
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[8]蝙蝠呼肠孤病毒感染BHK-21和Vero-E6细胞形态发生的比较观察[J]. 孟轲音,杜林峰,涂长春,段铭,邹啸环.  中国病原生物学杂志. 2010(02)
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[10]流式细胞术检测石见穿多糖诱导的肝癌细胞凋亡率[J]. 郑海音,武一曼,林信富,陈素娟.  福建中医学院学报. 2009(03)

硕士论文
[1]3株鸭源呼肠孤病毒对鸭胚成纤维细胞致病性研究[D]. 余爱花.华中农业大学 2012
[2]鸭源呼肠孤病毒荧光定量RT-PCR方法的建立与应用[D]. 杨旭.华中农业大学 2011
[3]鸭源禽呼肠孤病毒感染雏鸭的免疫病理学研究[D]. 李爽.华中农业大学 2010
[4]鸭源呼肠孤病毒的分离与鉴定[D]. 张宝来.华中农业大学 2009
[5]禽呼肠孤病毒S3、S4基因的克隆与序列分析[D]. 李建云.内蒙古农业大学 2007
[6]番鸭呼肠孤病毒感染番鸭的组织学病变及细胞凋亡研究[D]. 陈晓燕.福建农林大学 2007



本文编号：3274298