单核细胞增生性李斯特菌LAMP-浊度/荧光检测方法的建立
发布时间：2021-07-13 07:51
将环介导等温扩增技术（LAMP）分别与浊度信号检测系统（turbidimeter）和荧光信号检测系统（fluorescence）相结合,建立了LAMP-浊度/荧光单核细胞增生性李斯特菌检测方法。选择单核细胞增生性李斯特菌保守毒力基因iap序列,通过环介导等温扩增引物设计在线软件设计4条特异性引物,进行反应条件的优化,并对建立的LAMP的特异性和灵敏度进行评价分析。结果表明,构建的LAMP-浊度信号检测方法优化后的扩增温度为61℃,菌液最低检测浓度为22.1 CFU/mL,灵敏度是普通PCR扩增方法的10倍;LAMP-荧光信号检测方法优化后的扩增温度为64℃,菌液最低检测浓度为2.21 CFU/mL,灵敏度是普通PCR扩增方法的100倍;建立的两种LAMP方法的特异性良好,其中1株单核细胞增生性李斯特菌标准菌株和1株本试验分离保存的单核细胞增生性李斯特菌检测结果均为阳性,8株非单核细胞增生性李斯特菌检测结果均为阴性。利用两种LAMP方法对630份肉类及其制品、人工污染样品等进行检测,检出45个LAMP阳性,与国标法（GB）检测结果一致。结果表明,建立优化的单核细胞增生性李斯特菌LAMP-...
【文章来源】：动物医学进展. 2020,41(07)北大核心
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
在64 ℃ LAMP-荧光信号检测方法扩增
利用恒温(浊度)扩增基因检测系统进行恒温扩增,同时对浊度信号监测,由图1可以看出,反应进行30 min内,分别在60 ℃～65 ℃ 6个温度扩增时,浊度值均明显上升,说明有目的片段的扩增,浊度信号出峰时间最早,Tm值为25:28,61 ℃时的扩增曲线见图1。因此,LAMP-浊度信号检测方法选择61 ℃作为后续试验的反应温度。利用OptiGene基因扩增仪进行反应,整个过程进行荧光信号监测,图2可以看出,反应进行30 min内,分别在60 ℃～65 ℃ 6个温度扩增时,荧光信号均明显上升,同时反应在64 ℃时荧光信号出峰时间最早(图2),峰值为21:29。因此,LAMP-荧光信号检测方法选择64 ℃作为后续试验的反应温度。
单核细胞增生性李斯特菌液原浓度为(229+207+228)/3×104×10=2.21×107 CFU/mL,对菌液做10倍系列稀释(表3),当用浊度仪检测时,当菌液在107～101稀释范围内均出现浊度的明显变化,呈LAMP阳性,因此,LAMP-浊度信号检测方法菌液最低检出浓度为22.1 CFU/mL。由表4可知,当用荧光检测仪检测时,菌液在107～100稀释范围内均出现荧光信号的明显变化,呈LAMP阳性。因此,LAMP-荧光信号检测方法菌液最低检出浓度为2.21 CFU/mL。由图5可知,当稀释范围在107～103时,均会出现204 bp的PCR扩增特异性条带。因此,PCR扩增最低菌液检出浓度为221 CFU/mL。图4 LAMP-荧光信号检测方法特异性试验
【参考文献】：
期刊论文
[1]单增李斯特菌RT-LAMP快速检测方法的建立[J]. 周振森,丁梦璇,梁玉林,周鹏飞,尹建军,刘秀. 食品工业. 2019(04)
[2]改良LAMP检测鸡肉中单增李斯特氏菌的研究[J]. 冯显显,杨倩,张先舟,马晓燕,李英军,张伟,王建昌,陈启跃. 食品研究与开发. 2018(19)
[3]环介导等温扩增技术快速检测食源性致病菌的研究进展[J]. 辛亮,崔艳华,张兰威. 中国食品学报. 2018(03)
[4]食品中单增李斯特菌荧光PCR检测方法的建立[J]. 刘芳,徐振娜,洪伟彬,谢海燕. 农村经济与科技. 2017(17)
[5]食源性单核增生性李斯特氏菌毒力基因的分布[J]. 亢春雨,于宏伟,郭润芳,贾英民,张楠. 中国食品学报. 2017(03)
[6]环介导等温扩增技术与横向流动试纸条法快速检测单增李斯特菌的研究[J]. 李秀梅,梁智选,李颖,郭恋,王虹,关建军,王红军. 中国预防兽医学报. 2016(10)
[7]LAMP法检测单核细胞增生性李斯特菌的研究[J]. 顾思宇,张红星,金君华,谢远红. 食品科技. 2016(08)
[8]食品中单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度（LAMP）检测方法的建立[J]. 黄朱梁,薛超波,孙瑛,王萍亚. 食品工业. 2015(01)
[9]食品中李斯特菌污染状况研究[J]. 冯家望,吴小伦,陈静静,王小玉,李丹琳,唐食明,游淑珠. 中国食品卫生杂志. 2007(01)
[10]食品中单核增生性李斯特菌的PCR快速检测研究[J]. 冯家望,吴小伦,黄云君,王小玉,薄清如,陈静静. 中国食品卫生杂志. 2005(03)
本文编号：3281670
【文章来源】：动物医学进展. 2020,41(07)北大核心
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
在64 ℃ LAMP-荧光信号检测方法扩增
利用恒温(浊度)扩增基因检测系统进行恒温扩增,同时对浊度信号监测,由图1可以看出,反应进行30 min内,分别在60 ℃～65 ℃ 6个温度扩增时,浊度值均明显上升,说明有目的片段的扩增,浊度信号出峰时间最早,Tm值为25:28,61 ℃时的扩增曲线见图1。因此,LAMP-浊度信号检测方法选择61 ℃作为后续试验的反应温度。利用OptiGene基因扩增仪进行反应,整个过程进行荧光信号监测,图2可以看出,反应进行30 min内,分别在60 ℃～65 ℃ 6个温度扩增时,荧光信号均明显上升,同时反应在64 ℃时荧光信号出峰时间最早(图2),峰值为21:29。因此,LAMP-荧光信号检测方法选择64 ℃作为后续试验的反应温度。
单核细胞增生性李斯特菌液原浓度为(229+207+228)/3×104×10=2.21×107 CFU/mL,对菌液做10倍系列稀释(表3),当用浊度仪检测时,当菌液在107～101稀释范围内均出现浊度的明显变化,呈LAMP阳性,因此,LAMP-浊度信号检测方法菌液最低检出浓度为22.1 CFU/mL。由表4可知,当用荧光检测仪检测时,菌液在107～100稀释范围内均出现荧光信号的明显变化,呈LAMP阳性。因此,LAMP-荧光信号检测方法菌液最低检出浓度为2.21 CFU/mL。由图5可知,当稀释范围在107～103时,均会出现204 bp的PCR扩增特异性条带。因此,PCR扩增最低菌液检出浓度为221 CFU/mL。图4 LAMP-荧光信号检测方法特异性试验
【参考文献】：
期刊论文
[1]单增李斯特菌RT-LAMP快速检测方法的建立[J]. 周振森,丁梦璇,梁玉林,周鹏飞,尹建军,刘秀. 食品工业. 2019(04)
[2]改良LAMP检测鸡肉中单增李斯特氏菌的研究[J]. 冯显显,杨倩,张先舟,马晓燕,李英军,张伟,王建昌,陈启跃. 食品研究与开发. 2018(19)
[3]环介导等温扩增技术快速检测食源性致病菌的研究进展[J]. 辛亮,崔艳华,张兰威. 中国食品学报. 2018(03)
[4]食品中单增李斯特菌荧光PCR检测方法的建立[J]. 刘芳,徐振娜,洪伟彬,谢海燕. 农村经济与科技. 2017(17)
[5]食源性单核增生性李斯特氏菌毒力基因的分布[J]. 亢春雨,于宏伟,郭润芳,贾英民,张楠. 中国食品学报. 2017(03)
[6]环介导等温扩增技术与横向流动试纸条法快速检测单增李斯特菌的研究[J]. 李秀梅,梁智选,李颖,郭恋,王虹,关建军,王红军. 中国预防兽医学报. 2016(10)
[7]LAMP法检测单核细胞增生性李斯特菌的研究[J]. 顾思宇,张红星,金君华,谢远红. 食品科技. 2016(08)
[8]食品中单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度（LAMP）检测方法的建立[J]. 黄朱梁,薛超波,孙瑛,王萍亚. 食品工业. 2015(01)
[9]食品中李斯特菌污染状况研究[J]. 冯家望,吴小伦,陈静静,王小玉,李丹琳,唐食明,游淑珠. 中国食品卫生杂志. 2007(01)
[10]食品中单核增生性李斯特菌的PCR快速检测研究[J]. 冯家望,吴小伦,黄云君,王小玉,薄清如,陈静静. 中国食品卫生杂志. 2005(03)
本文编号：3281670
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