基于猪流行性腹泻病毒S蛋白纳米抗体的阻断ELISA方法的建立

发布时间：2021-07-13 23:27

　　猪流行性腹泻病毒（PEDV）,冠状病毒成员。2010年底,我国发生了大范围严重的猪流行性腹泻（PED）疫情,造成了巨大的经济损失。发病猪可见呕吐、水样腹泻、脱水等临床症状,造成猪生长迟缓,甚至死亡,被PEDV感染的仔猪死亡率较高,对发病猪进行病理检查可见萎缩性肠炎。PED的临床症状与组织病理学特征类似于猪传染性胃肠炎（TGE）,所以这两种疾病的鉴别诊断主要依靠分子和血清学检测。PEDV包含4个结构蛋白和17种非结构蛋白,其中纤突蛋白（S）以三聚体的形式定位在病毒表面,其主要介导病毒与细胞膜融合和受体结合等基本生物功能,并包含多个中和表位,可以诱导宿主产生中和抗体。因此,猪血清中PEDV S蛋白的抗体水平更能代表猪体内的中和抗体水平。本研究将纯化后的截短PEDV S重组蛋白通过皮下注射免疫双峰驼,并利用噬菌体展示技术共筛选出6株氨基酸序列不相同的纳米抗体。之后,我们将一株纳米抗体进行了生物素标记,并建立了一种检测猪血清中PEDV S蛋白抗体的阻断ELISA方法。主要内容与结果如下:1.将纯化后的截短PEDV S重组蛋白通过皮下注射免疫双峰驼,四次免疫后,双峰驼血清中的特异性抗体效价达到了... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：74 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
文献综述
    第一章 猪流行性腹泻病毒与纳米抗体的研究进展
        1.1 猪流行性腹泻病毒的研究进展
            1.1.1 猪流行性腹泻病毒的概述
            1.1.2 猪流行性腹泻的流行情况
            1.1.3 猪流行性腹泻病毒的分子病原学
        1.2 纳米抗体
            1.2.1 纳米抗体结构特征
            1.2.2 纳米抗体的优势
            1.2.3 纳米抗体的临床应用
        1.3 本研究的目的与意义
试验研究
    第二章 PEDV S蛋白特异性纳米抗体文库的构建及纳米抗体的筛选与鉴定
        2.1 试验材料
            2.1.1 主要仪器及耗材
            2.1.2 主要试剂
        2.2 试验方法
            2.2.1 VHH噬菌体展示文库的构建
            2.2.2 PEDV S蛋白特异性纳米抗体的筛选
        2.3 结果
            2.3.1 双峰驼免疫
            2.3.2 VHH噬菌体展示文库的构建
            2.3.3 PEDV S蛋白特异性纳米抗体的筛选
            2.3.4 PEDV S蛋白纳米抗体特异性及效价的测定
        2.4 讨论
        2.5 小结
    第三章 PEDV S蛋白纳米抗体Nb3的表达、纯化及生物素化标记
        3.1 试验材料
            3.1.1 感受态、载体及主要试剂
            3.1.2 主要仪器
        3.2 试验方法
            3.2.1 原核表达载体pET21b-Nb3-Avitag的构建
            3.2.2 纳米抗体Nb3-Avitag融合蛋白的表达与可溶性鉴定
            3.2.3 Nb3-Avitag重组蛋白的纯化
            3.2.4 Nb3-Avitag融合蛋白的生物素化
            3.2.5 Nb3-Avitag融合蛋白生物素标记的效果验证
        3.3 结果
            3.3.1 pET21b-Nb3-Avitag原核表达载体的构建
            3.3.2 重组纳米抗体Nb3-Avitag融合蛋白在大肠杆菌中的表达与可溶性鉴定
            3.3.3 Nb3-Avitag融合蛋白的纯化
            3.3.4 Nb3-Avitag融合蛋白生物素标记的效果验证
        3.4 讨论
        3.5 小结
    第四章 基于生物素化纳米抗体检测猪血清中PEDV S蛋白抗体的阻断ELISA方法的建立
        4.1 试验材料
        4.2 试验方法
            4.2.1 摸索最佳抗原包被量与纳米抗体稀释比例
            4.2.2 确定最佳血清稀释比例
            4.2.3 确定血清最佳孵育时间
            4.2.4 确定Nb3-Biotin最佳孵育时间
            4.2.5 确定酶标二抗最佳孵育时间
            4.2.6 阻断ELISA临界值的确定
            4.2.7 重复性评价
            4.2.8 特异性评价
            4.2.9 符合率评价
        4.3 结果
            4.3.1 摸索最佳抗原包被量与纳米抗体稀释比例
            4.3.2 确定最佳血清稀释比例
            4.3.3 确定血清最佳孵育时间
            4.3.4 确定Nb3-Biotin最佳孵育时间
            4.3.5 确定酶标二抗最佳孵育时间
            4.3.6 阻断ELISA临界值的确定
            4.3.7 重复性评价
            4.3.8 特异性评价
            4.3.9 符合率评价
        4.4 讨论
        4.5 小结
结论
附录
参考文献
致谢
个人简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒检测方法的研究进展[J]. 李亚兰,袁晓民,湛洋,杨凌宸,胡意,谭磊,刘谭彬,郭时印,王爱兵.  中国兽医科学. 2019(03)
[2]PEDV疫苗株与野毒株RT-PCR鉴别诊断方法的建立及临床应用[J]. 宋予震,董青,梁中涛,霍军.  中国兽医杂志. 2016(10)
[3]半巢式PCR法构建天然噬菌体单域重链抗体文库[J]. 涂追,许杨,何庆华,陶勇.  食品科学. 2010(19)
[4]纳米抗体的研究进展[J]. 王更如,姜广水,审阅.  现代免疫学. 2010(01)



本文编号：3282931