环形泰勒虫裂殖体与宿主细胞互作分子的筛选及功能研究
发布时间：2021-07-13 21:58
热带泰勒虫病（Tropical theileriasis）是由环形泰勒虫（Theileria annulata）感染引起的蜱传性血液原虫病,患病动物通常表现出体表淋巴结肿大、高热、贫血、消瘦等临床症状。环形泰勒虫裂殖体感染的宿主单核/巨噬细胞、树突状细胞及B淋巴细胞在体外培养时能够无限增殖,表现出癌细胞的生长特性,即转化特性;当感染细胞用抗寄生虫药物布帕伐醌（Buparvaquone,BW720c）处理后,宿主细胞恢复正常细胞的生长及凋亡特性。参考环形泰勒虫基因组、蛋白组数据,同时结合相关文献,本研究选取可能参与细胞转化的环形泰勒虫裂殖体膜蛋白或分泌蛋白,利用酵母双杂交技术,筛选与其相互作用的宿主细胞蛋白。对环形泰勒虫裂殖体感染的细胞系TaNM1细胞进行siRNA干扰及药物处理后,检测信号通路关键分子基因的表达及蛋白磷酸化水平,从而了解互作蛋白分子对宿主细胞信号通路的影响,为阐明环形泰勒虫调节宿主细胞转化的分子机制奠定基础。主要研究结果如下:1.成功构建环形泰勒虫的7个转化相关基因TaSP、SVSP2、EMM、Glu、CP、URP及Cyp1的pET30a原核表达载体,经诱导表达后,纯化...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：95 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
环形泰勒虫生活史Fig.1.1LifecycleofTheileriaannulata(Tretinaetal.,2015)
图 2.1 目的蛋白跨膜区及信号肽预测Fig. 2.1 The transmembrane and signal peptide prediction of target proteins2.3.2 重组质粒的构建及目的蛋白的表达纯化以 TaNM1 cDNA 为模板，经 PCR 扩增获得片段大小分别为：Tasp，约 558 bp；SVSP2，约1167 bp；CP，约 1050 bp ；Glu，约 387 bp；Cyp1，约 624 bp；URP，约 1017 bp；EMM，约1308 bp，与预期大小一致（图 2.2）。将测序正确的质粒转化至 BL21(DE3)中，进行诱导表达。经 SDS-PAGE 及 western blot 鉴定，7 种重组蛋白都得到表达（图 2.3 和图 2.4），大小分别为：Tasp，约 50 kDa；SVSP2，约 70 kDa；CP，约 45 kDa ；Glu，约 20 kDa；Cyp1，约 28 kDa；URP，约 42 kDa；EMM，约 55 kDa，除 Tasp 及 SVSP2 外，其他 5 个蛋白大小与预测一致。其中 TaSP 明显偏大，这可能与其富含 Glu-Pro 及 Gln-Pro 结构有关，导致该蛋白在电泳时迁移速率变慢（Schnittger et al., 2002）。此外通过切胶回收、丙酮沉淀及的蛋白稀释方法对这 7 种目的蛋白进行纯化，经 Bardford 法测定，这 7 种蛋白的浓度均在 0.3 mg/mL 左右。Western blot 结果显示：7 个纯化的目的蛋白条带单一，而且均能与抗 His 标签蛋白的抗体反应（图 2.5），表明纯化的蛋白可用于多克隆抗体的制备。
重组目的蛋白的SDS-PAGE分析
【参考文献】：
期刊论文
[1]Notch信号通路在肿瘤干细胞中的研究进展[J]. 张奇,宋鑫. 中国肿瘤. 2014(07)
[2]Notch信号通路与肿瘤研究[J]. 刘兆国,朱智杰,周梁,田超,王爱云,陈文星,郑仕中,陆茵. 中国药理学通报. 2012(08)
[3]蛋白质相互作用组学研究策略最新进展[J]. 黄泽民,倪兵. 免疫学杂志. 2010(07)
[4]牛环形泰勒焦虫病的诊断与防治[J]. 曹喜阳,李晓莹,高艳华,高艳秋,王梅. 畜牧兽医科技信息. 2007(11)
[5]c-Myc功能及其下游靶点[J]. 白阳,叶健,王敬泽. 细胞生物学杂志. 2007(02)
[6]小亚璃眼蜱对牛巴贝斯虫未定种和环形泰勒虫传播的试验研究[J]. 罗建勋,殷宏,关贵全,马米玲,孙彩琴,鲁炳义,白启,吕文顺,陈溥言. 畜牧兽医学报. 2005(11)
[7]我国牛蜱传性血液原虫的虫种调查和分布特征的研究[J]. 吕文祥,吕文顺,张其才,罗建勋,殷宏,窦惠芳. 中国兽医科技. 1995(08)
本文编号：3282876
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：95 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
环形泰勒虫生活史Fig.1.1LifecycleofTheileriaannulata(Tretinaetal.,2015)
图 2.1 目的蛋白跨膜区及信号肽预测Fig. 2.1 The transmembrane and signal peptide prediction of target proteins2.3.2 重组质粒的构建及目的蛋白的表达纯化以 TaNM1 cDNA 为模板，经 PCR 扩增获得片段大小分别为：Tasp，约 558 bp；SVSP2，约1167 bp；CP，约 1050 bp ；Glu，约 387 bp；Cyp1，约 624 bp；URP，约 1017 bp；EMM，约1308 bp，与预期大小一致（图 2.2）。将测序正确的质粒转化至 BL21(DE3)中，进行诱导表达。经 SDS-PAGE 及 western blot 鉴定，7 种重组蛋白都得到表达（图 2.3 和图 2.4），大小分别为：Tasp，约 50 kDa；SVSP2，约 70 kDa；CP，约 45 kDa ；Glu，约 20 kDa；Cyp1，约 28 kDa；URP，约 42 kDa；EMM，约 55 kDa，除 Tasp 及 SVSP2 外，其他 5 个蛋白大小与预测一致。其中 TaSP 明显偏大，这可能与其富含 Glu-Pro 及 Gln-Pro 结构有关，导致该蛋白在电泳时迁移速率变慢（Schnittger et al., 2002）。此外通过切胶回收、丙酮沉淀及的蛋白稀释方法对这 7 种目的蛋白进行纯化，经 Bardford 法测定，这 7 种蛋白的浓度均在 0.3 mg/mL 左右。Western blot 结果显示：7 个纯化的目的蛋白条带单一，而且均能与抗 His 标签蛋白的抗体反应（图 2.5），表明纯化的蛋白可用于多克隆抗体的制备。
重组目的蛋白的SDS-PAGE分析
【参考文献】：
期刊论文
[1]Notch信号通路在肿瘤干细胞中的研究进展[J]. 张奇,宋鑫. 中国肿瘤. 2014(07)
[2]Notch信号通路与肿瘤研究[J]. 刘兆国,朱智杰,周梁,田超,王爱云,陈文星,郑仕中,陆茵. 中国药理学通报. 2012(08)
[3]蛋白质相互作用组学研究策略最新进展[J]. 黄泽民,倪兵. 免疫学杂志. 2010(07)
[4]牛环形泰勒焦虫病的诊断与防治[J]. 曹喜阳,李晓莹,高艳华,高艳秋,王梅. 畜牧兽医科技信息. 2007(11)
[5]c-Myc功能及其下游靶点[J]. 白阳,叶健,王敬泽. 细胞生物学杂志. 2007(02)
[6]小亚璃眼蜱对牛巴贝斯虫未定种和环形泰勒虫传播的试验研究[J]. 罗建勋,殷宏,关贵全,马米玲,孙彩琴,鲁炳义,白启,吕文顺,陈溥言. 畜牧兽医学报. 2005(11)
[7]我国牛蜱传性血液原虫的虫种调查和分布特征的研究[J]. 吕文祥,吕文顺,张其才,罗建勋,殷宏,窦惠芳. 中国兽医科技. 1995(08)
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