小尾寒羊miR-221和miR-329b-3p功能研究及其与IRS1基因的靶向关系验证
发布时间：2021-07-17 10:26
绵羊的泌乳性状是一个重要的经济性状,它显著影响了后代羔羊的成活率和生长速度等性能。乳腺发育程度以及乳腺上皮细胞的数量和分泌活性直接决定了母羊的产奶量和乳成分。microRNA（miRNA）是真核生物中广泛存在的一类非编码小RNA分子,它们在动物泌乳性状调控方面发挥了重要作用。课题组前期采集了泌乳高峰期和空怀期小尾寒羊的乳腺组织,进行了small RNA-Seq,在两组间发现了23个差异表达miRNAs,其中miR-221和miR-329b-3p在空怀期乳腺中的表达量显著上调。因此,本研究以这两个miRNAs为研究对象,首先用实时荧光定量PCR（Reverse Transcription-Quantitative PCR,RT-qPCR）验证了它们的表达量,用CCK-8试剂盒检测了它们对绵羊乳腺上皮细胞增殖的影响,其次预测了它们的靶基因,分析了靶基因的GO和KEGG功能富集。最后用双荧光素酶报告实验和RT-qPCR等方法,验证了miR-221和miR-329b-3p与预测靶基因IRS1的靶向关系,并研究了miR-221和miR-329b-3p对靶基因IRS1及IRS1参与的PI3K/AK...
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
奶牛乳房右前乳区解剖示意图[5]
小尾寒羊miR-221和miR-329b-3p功能研究及其与IRS1基因的靶向关系验证13保存。2.7.1.2pmiR-RB-Report载体图谱pmiR-RB-Report载体是专门用来检测miRNA作用的检测工具。在载体中，以海肾荧光素酶基因作为报告基因，以萤火虫荧光素酶基因（hLuc）作为内参基因，通过检测海肾荧光素酶活性的相对变化，来鉴定miRNA对该基因是否有调控作用。将靶基因的3′UTR区克隆至载体的海肾荧光素酶基因（hRluc）下游位点，载体图谱见图2-1。图2-1pmiR-RB-Report载体图谱Figure2-1pmiR-RB-Reportvectoratlas注：hRluc为海肾荧光素酶基因，是报告基因；hLuc+为萤火虫荧光素酶基因，是内参基因；3′UTRRegion是靶基因3′UTR区域的连接位点；Ampr是氨苄青霉素抗性基因，用于大肠杆菌阳性克隆子筛眩2.7.1.3扩增产物与pmiR-RB-Report载体的酶切及纯化（1）扩增产物的纯化将IRS1基因3′UTR的扩增产物（或酶切产物）加水补充到100μL，加入500μL的BufferGDP，颠倒或涡旋混匀后加入到吸附柱中，将吸附柱套在收集管中，在12000rpm下离心1min。弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入700μLBufferGW（含无水乙醇）至吸附柱中，12000rpm下离心1min（重复此操作1次）。弃滤液，把吸附柱置于收集管中，12000rpm下离心2min。将吸附柱置于在1.5mL灭菌的离心管中，加入20μLElutionBuffer至吸附柱中央，放置2min，12000rpm下离心1min。弃去吸附柱，把DNA保存于-20℃。（2）酶切将纯化产物与pmiR-RB-Report载体分别置于PCR管中，加入内切酶酶切（酶切体系见表2-5），轻轻混匀后瞬时离心，置于37℃恒温水浴锅中水浴10min。
甘肃农业大学2020届硕士学位论文20第三章结果与分析1绵羊乳腺上皮细胞的原代培养与鉴定1.1绵羊乳腺上皮细胞的原代培养采用胶原酶I消化乳腺的实质部分后，得到了大量的细胞。根据成纤维细胞和乳腺上皮细胞对胰酶的耐受性不同，来分离和纯化乳腺上皮细胞。纯化后的绵羊乳腺上皮细胞用全培养液培养，具体生长过程为：第一天，绵羊乳腺上皮细胞生长缓慢、细胞体积校第三天，细胞体积变大，开始聚集生长。第四天，细胞大量增殖，有的细胞聚集在一起形成闭合的细胞群，呈“岛屿状”生长，此时细胞已经铺满了培养板的50%。第五天，细胞继续增殖，成群生长，铺满了培养板的80%，呈现出明显的“铺路石”状（图3-1）。图3-1绵羊乳腺上皮细胞的培养（100×）Figure3-1Thecultivationoftheovinemammaryglandepithelialcells（100×）1.2绵羊乳腺上皮细胞鉴定荧光倒置显微镜观察发现：在原代培养的细胞中，乳腺上皮细胞的标志性蛋白（角蛋白18,Keratin18）在细胞质中呈阳性表达（图3-2A），而成纤维细胞的标志性蛋白（波形蛋白,Vimentin）在细胞质和细胞核（蓝色）中均不表达（图3-2B）。这表明本试验获得了纯的绵羊乳腺上皮细胞，可以作为后续的研究材料。
【参考文献】：
期刊论文
[1]miR-25 modulates triacylglycerol and lipid accumulation in goat mammary epithelial cells by repressing PGC-1beta[J]. Liuan Ma,Huiling Qiu,Zhi Chen,Li Li,Yan Zeng,Jun Luo,Deming Gou. Journal of Animal Science and Biotechnology. 2018(04)
[2]绵羊STAT5a基因的组织表达及核苷酸序列变异分析[J]. 郝志云,王继卿,胡江,刘秀,李少斌,张亚强,王冠,罗玉柱. 农业生物技术学报. 2018(01)
[3]海南黑山羊繁殖周期生殖激素的分泌规律研究[J]. 华蕊,张海文,吴科榜. 黑龙江畜牧兽医. 2018(01)
[4]奶用后备牛不同生理阶段乳腺发育特点及营养调控作用[J]. 崔祥,刁其玉,屠焰. 中国奶牛. 2014(Z1)
[5]秦川牛IRS-1基因多态性与体尺和肉质性状的相关性[J]. 马向辉,昝林森,高建斌,杨宁,朱光星,成功,王洪宝,郝瑞杰,付常振,姜碧杰,詹小立,白银萍. 畜牧兽医学报. 2012(08)
[6]人类胞内蛋白半衰期与其亚细胞定位的相关性研究[J]. 贾浩,张小白,宋晓峰. 计算机与应用化学. 2011(04)
[7]奶山羊乳腺上皮细胞的分离、培养及鉴定[J]. 王桢,罗军,王伟,赵旺生,林先滋. 生物工程学报. 2010(08)
[8]miRNA研究进展[J]. 刘强,郑秀峰,辛永红. 重庆医学. 2009(15)
[9]奶山羊乳腺上皮细胞系的建立[J]. 佟慧丽,尹德云,李庆章,高学军. 东北农业大学学报. 2008(08)
[10]胰岛素受体底物-1/-2与胰岛素信号转导[J]. 舒适,宋菊敏. 医学综述. 2008(05)
博士论文
[1]奶山羊乳腺能量代谢研究[D]. 张娜.东北农业大学 2010
硕士论文
[1]pik3r1通过PI3K-AKT-mTOR通路影响小鼠子宫内膜的蜕膜化进程[D]. 倪明云.重庆医科大学 2018
[2]Wnt信号通路激活剂BIO在山羊乳腺上皮细胞形成腺泡样结构中的调控作用[D]. 孟凯.西北农林科技大学 2015
[3]MiR-200a对奶山羊乳腺上皮细胞脂代谢的调控作用研究[D]. 张犁苹.西北农林科技大学 2013
本文编号：3287992
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
奶牛乳房右前乳区解剖示意图[5]
小尾寒羊miR-221和miR-329b-3p功能研究及其与IRS1基因的靶向关系验证13保存。2.7.1.2pmiR-RB-Report载体图谱pmiR-RB-Report载体是专门用来检测miRNA作用的检测工具。在载体中，以海肾荧光素酶基因作为报告基因，以萤火虫荧光素酶基因（hLuc）作为内参基因，通过检测海肾荧光素酶活性的相对变化，来鉴定miRNA对该基因是否有调控作用。将靶基因的3′UTR区克隆至载体的海肾荧光素酶基因（hRluc）下游位点，载体图谱见图2-1。图2-1pmiR-RB-Report载体图谱Figure2-1pmiR-RB-Reportvectoratlas注：hRluc为海肾荧光素酶基因，是报告基因；hLuc+为萤火虫荧光素酶基因，是内参基因；3′UTRRegion是靶基因3′UTR区域的连接位点；Ampr是氨苄青霉素抗性基因，用于大肠杆菌阳性克隆子筛眩2.7.1.3扩增产物与pmiR-RB-Report载体的酶切及纯化（1）扩增产物的纯化将IRS1基因3′UTR的扩增产物（或酶切产物）加水补充到100μL，加入500μL的BufferGDP，颠倒或涡旋混匀后加入到吸附柱中，将吸附柱套在收集管中，在12000rpm下离心1min。弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入700μLBufferGW（含无水乙醇）至吸附柱中，12000rpm下离心1min（重复此操作1次）。弃滤液，把吸附柱置于收集管中，12000rpm下离心2min。将吸附柱置于在1.5mL灭菌的离心管中，加入20μLElutionBuffer至吸附柱中央，放置2min，12000rpm下离心1min。弃去吸附柱，把DNA保存于-20℃。（2）酶切将纯化产物与pmiR-RB-Report载体分别置于PCR管中，加入内切酶酶切（酶切体系见表2-5），轻轻混匀后瞬时离心，置于37℃恒温水浴锅中水浴10min。
甘肃农业大学2020届硕士学位论文20第三章结果与分析1绵羊乳腺上皮细胞的原代培养与鉴定1.1绵羊乳腺上皮细胞的原代培养采用胶原酶I消化乳腺的实质部分后，得到了大量的细胞。根据成纤维细胞和乳腺上皮细胞对胰酶的耐受性不同，来分离和纯化乳腺上皮细胞。纯化后的绵羊乳腺上皮细胞用全培养液培养，具体生长过程为：第一天，绵羊乳腺上皮细胞生长缓慢、细胞体积校第三天，细胞体积变大，开始聚集生长。第四天，细胞大量增殖，有的细胞聚集在一起形成闭合的细胞群，呈“岛屿状”生长，此时细胞已经铺满了培养板的50%。第五天，细胞继续增殖，成群生长，铺满了培养板的80%，呈现出明显的“铺路石”状（图3-1）。图3-1绵羊乳腺上皮细胞的培养（100×）Figure3-1Thecultivationoftheovinemammaryglandepithelialcells（100×）1.2绵羊乳腺上皮细胞鉴定荧光倒置显微镜观察发现：在原代培养的细胞中，乳腺上皮细胞的标志性蛋白（角蛋白18,Keratin18）在细胞质中呈阳性表达（图3-2A），而成纤维细胞的标志性蛋白（波形蛋白,Vimentin）在细胞质和细胞核（蓝色）中均不表达（图3-2B）。这表明本试验获得了纯的绵羊乳腺上皮细胞，可以作为后续的研究材料。
【参考文献】：
期刊论文
[1]miR-25 modulates triacylglycerol and lipid accumulation in goat mammary epithelial cells by repressing PGC-1beta[J]. Liuan Ma,Huiling Qiu,Zhi Chen,Li Li,Yan Zeng,Jun Luo,Deming Gou. Journal of Animal Science and Biotechnology. 2018(04)
[2]绵羊STAT5a基因的组织表达及核苷酸序列变异分析[J]. 郝志云,王继卿,胡江,刘秀,李少斌,张亚强,王冠,罗玉柱. 农业生物技术学报. 2018(01)
[3]海南黑山羊繁殖周期生殖激素的分泌规律研究[J]. 华蕊,张海文,吴科榜. 黑龙江畜牧兽医. 2018(01)
[4]奶用后备牛不同生理阶段乳腺发育特点及营养调控作用[J]. 崔祥,刁其玉,屠焰. 中国奶牛. 2014(Z1)
[5]秦川牛IRS-1基因多态性与体尺和肉质性状的相关性[J]. 马向辉,昝林森,高建斌,杨宁,朱光星,成功,王洪宝,郝瑞杰,付常振,姜碧杰,詹小立,白银萍. 畜牧兽医学报. 2012(08)
[6]人类胞内蛋白半衰期与其亚细胞定位的相关性研究[J]. 贾浩,张小白,宋晓峰. 计算机与应用化学. 2011(04)
[7]奶山羊乳腺上皮细胞的分离、培养及鉴定[J]. 王桢,罗军,王伟,赵旺生,林先滋. 生物工程学报. 2010(08)
[8]miRNA研究进展[J]. 刘强,郑秀峰,辛永红. 重庆医学. 2009(15)
[9]奶山羊乳腺上皮细胞系的建立[J]. 佟慧丽,尹德云,李庆章,高学军. 东北农业大学学报. 2008(08)
[10]胰岛素受体底物-1/-2与胰岛素信号转导[J]. 舒适,宋菊敏. 医学综述. 2008(05)
博士论文
[1]奶山羊乳腺能量代谢研究[D]. 张娜.东北农业大学 2010
硕士论文
[1]pik3r1通过PI3K-AKT-mTOR通路影响小鼠子宫内膜的蜕膜化进程[D]. 倪明云.重庆医科大学 2018
[2]Wnt信号通路激活剂BIO在山羊乳腺上皮细胞形成腺泡样结构中的调控作用[D]. 孟凯.西北农林科技大学 2015
[3]MiR-200a对奶山羊乳腺上皮细胞脂代谢的调控作用研究[D]. 张犁苹.西北农林科技大学 2013
本文编号：3287992
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