小反刍兽疫病毒F和H蛋白在CHO细胞中的融合表达及其免疫原性的研究
发布时间：2021-07-20 04:53
以小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）疫苗株Nigeria75/1基因序列为基础,构建了融合表达PPRV囊膜蛋白F和H胞外区的真核重组质粒pcDNA3.1-F-H,在悬浮CHO细胞中进行分泌表达。离心收集转染后的细胞培养上清进行亲和层析纯化,纯化样品经Western-blot鉴定,融合蛋白与PPRV阳性血清和His标签抗体都能发生免疫反应。使用纯化后的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,可诱导小鼠体内产生针对PPRV的特异性抗体。上述研究结果为小反刍兽疫新型亚单位疫苗的研制奠定了基础。
【文章来源】：中国兽医科学. 2020,50(06)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
PPRVF-H基因融合表达分子设计策略Figure1PPRVF-HgeneexpressionmoleculedesignstrategyA：F蛋白信号肽分析：SignalP4.1Server软件分析显示1～19位氨基酸为F蛋白信号肽；B：F蛋白跨膜区分析：TMHMMServerv.2.0软件分析
RT-PCR扩增结果经核酸凝胶电泳鉴定显示，两个扩增片段的大小分别约为1650bp和1060bp（见图2），与预期大小相符，编码PPRVF和H蛋白胞外区的基因得到有效扩增。2.2重组克隆质粒的双酶切鉴定如图3所示，构建的重组质粒pcDNA3.1-F-H经AflⅡ＋NotⅠ双酶切后产生约5000bp和3000bp的2条特异性条带，酶切产物大小与理论值相符，表明扩增的F与H片段正确融合并与载体连接，测序结果显示重组质粒构建成功。2.3重组质粒转染CHO细胞及鉴定离心收取转染pcDNA3.1-F-H重组质粒和pcDNA3.1空载体的细胞培养上清液，并设未转染的图2RT-PCR扩增的基因片段的电泳鉴定Figure2IdentificationresultsofgenefragmentsamplifiedbyRT-PCRM：DNA分子质量标准；1：H蛋白胞外区基因片段；2：F蛋白胞外区基因片段。M：DL2000DNAMarker；1：Hproteinextracellularregiongenefrag-ments；2：Fproteinextracellularregiongenefragments.M122000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图3重组克隆质粒的双酶切鉴定Figure3IdentificationofrecombinantcloningplasmidbydoubleenzymedigestionM：DNA分子质量标准；1：F-H基因；2：F-H基因酶切产物。M：DL12000DNAMarker；1：F-Hgene；2：F-Hgeneenzymedigestionproducts.12M12000bp8000bp6000bp5000bp4000bp3000bp2500bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp707
2h。将待检血清用血清稀释液从1∶4开始稀释并加入反应孔中，每孔100L，每个样品设3个复孔，37℃孵育1h。HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体用血清稀释液按1∶5000稀释后加入反应孔中，每孔100L，37℃孵育1h。TMB显色，每孔50L，显色10min后，加入每孔50L终止液终止反应，读取D450值。2结果2.1PPRVH基因和F基因的RT-PCR扩增RT-PCR扩增结果经核酸凝胶电泳鉴定显示，两个扩增片段的大小分别约为1650bp和1060bp（见图2），与预期大小相符，编码PPRVF和H蛋白胞外区的基因得到有效扩增。2.2重组克隆质粒的双酶切鉴定如图3所示，构建的重组质粒pcDNA3.1-F-H经AflⅡ＋NotⅠ双酶切后产生约5000bp和3000bp的2条特异性条带，酶切产物大小与理论值相符，表明扩增的F与H片段正确融合并与载体连接，测序结果显示重组质粒构建成功。2.3重组质粒转染CHO细胞及鉴定离心收取转染pcDNA3.1-F-H重组质粒和pcDNA3.1空载体的细胞培养上清液，并设未转染的图2RT-PCR扩增的基因片段的电泳鉴定Figure2IdentificationresultsofgenefragmentsamplifiedbyRT-PCRM：DNA分子质量标准；1：H蛋白胞外区基因片段；2：F蛋白胞外区基因片段。M：DL2000DNAMarker；1：Hproteinextracellularregiongenefrag-ments；2：Fproteinextracellularregiongenefragments.M122000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图3重组克隆质粒的双酶切鉴定Figure3IdentificationofrecombinantcloningplasmidbydoubleenzymedigestionM：DNA分子质量标准；1：F-H基因；2：F-H基因酶切产物。M：DL12000DNAMarker；1：F-Hgene；2：F-Hgeneenzymedigestionproducts.12M12000bp8000bp6000bp5000bp4000bp3000bp2500bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp707
【参考文献】：
期刊论文
[1]小反刍兽疫病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备[J]. 周岩岩,李玲霞,吴锦艳,余树芳,李娇阳,刘丹,冯倩,孙晶晶,何苗,魏凡华,尚佑军. 中国兽医科学. 2019(10)
[2]高新技术疫苗研究的现状与发展趋势[J]. 尼悦,党安坤,田召芳,王晓玲. 山东畜牧兽医. 2016(06)
硕士论文
[1]小反刍兽疫病毒F蛋白与H蛋白相互作用及F蛋白免疫原性研究[D]. 杨香芳.甘肃农业大学 2013
[2]小反刍兽疫病毒F、H基因的核酸疫苗及N蛋白的原核表达研究[D]. 阮洋.吉林农业大学 2011
[3]含塞姆利基森林病毒复制子的HIV多表位核酸疫苗的构建与表达[D]. 付延军.延边大学 2007
本文编号：3292171
【文章来源】：中国兽医科学. 2020,50(06)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
PPRVF-H基因融合表达分子设计策略Figure1PPRVF-HgeneexpressionmoleculedesignstrategyA：F蛋白信号肽分析：SignalP4.1Server软件分析显示1～19位氨基酸为F蛋白信号肽；B：F蛋白跨膜区分析：TMHMMServerv.2.0软件分析
RT-PCR扩增结果经核酸凝胶电泳鉴定显示，两个扩增片段的大小分别约为1650bp和1060bp（见图2），与预期大小相符，编码PPRVF和H蛋白胞外区的基因得到有效扩增。2.2重组克隆质粒的双酶切鉴定如图3所示，构建的重组质粒pcDNA3.1-F-H经AflⅡ＋NotⅠ双酶切后产生约5000bp和3000bp的2条特异性条带，酶切产物大小与理论值相符，表明扩增的F与H片段正确融合并与载体连接，测序结果显示重组质粒构建成功。2.3重组质粒转染CHO细胞及鉴定离心收取转染pcDNA3.1-F-H重组质粒和pcDNA3.1空载体的细胞培养上清液，并设未转染的图2RT-PCR扩增的基因片段的电泳鉴定Figure2IdentificationresultsofgenefragmentsamplifiedbyRT-PCRM：DNA分子质量标准；1：H蛋白胞外区基因片段；2：F蛋白胞外区基因片段。M：DL2000DNAMarker；1：Hproteinextracellularregiongenefrag-ments；2：Fproteinextracellularregiongenefragments.M122000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图3重组克隆质粒的双酶切鉴定Figure3IdentificationofrecombinantcloningplasmidbydoubleenzymedigestionM：DNA分子质量标准；1：F-H基因；2：F-H基因酶切产物。M：DL12000DNAMarker；1：F-Hgene；2：F-Hgeneenzymedigestionproducts.12M12000bp8000bp6000bp5000bp4000bp3000bp2500bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp707
2h。将待检血清用血清稀释液从1∶4开始稀释并加入反应孔中，每孔100L，每个样品设3个复孔，37℃孵育1h。HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体用血清稀释液按1∶5000稀释后加入反应孔中，每孔100L，37℃孵育1h。TMB显色，每孔50L，显色10min后，加入每孔50L终止液终止反应，读取D450值。2结果2.1PPRVH基因和F基因的RT-PCR扩增RT-PCR扩增结果经核酸凝胶电泳鉴定显示，两个扩增片段的大小分别约为1650bp和1060bp（见图2），与预期大小相符，编码PPRVF和H蛋白胞外区的基因得到有效扩增。2.2重组克隆质粒的双酶切鉴定如图3所示，构建的重组质粒pcDNA3.1-F-H经AflⅡ＋NotⅠ双酶切后产生约5000bp和3000bp的2条特异性条带，酶切产物大小与理论值相符，表明扩增的F与H片段正确融合并与载体连接，测序结果显示重组质粒构建成功。2.3重组质粒转染CHO细胞及鉴定离心收取转染pcDNA3.1-F-H重组质粒和pcDNA3.1空载体的细胞培养上清液，并设未转染的图2RT-PCR扩增的基因片段的电泳鉴定Figure2IdentificationresultsofgenefragmentsamplifiedbyRT-PCRM：DNA分子质量标准；1：H蛋白胞外区基因片段；2：F蛋白胞外区基因片段。M：DL2000DNAMarker；1：Hproteinextracellularregiongenefrag-ments；2：Fproteinextracellularregiongenefragments.M122000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图3重组克隆质粒的双酶切鉴定Figure3IdentificationofrecombinantcloningplasmidbydoubleenzymedigestionM：DNA分子质量标准；1：F-H基因；2：F-H基因酶切产物。M：DL12000DNAMarker；1：F-Hgene；2：F-Hgeneenzymedigestionproducts.12M12000bp8000bp6000bp5000bp4000bp3000bp2500bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp707
【参考文献】：
期刊论文
[1]小反刍兽疫病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备[J]. 周岩岩,李玲霞,吴锦艳,余树芳,李娇阳,刘丹,冯倩,孙晶晶,何苗,魏凡华,尚佑军. 中国兽医科学. 2019(10)
[2]高新技术疫苗研究的现状与发展趋势[J]. 尼悦,党安坤,田召芳,王晓玲. 山东畜牧兽医. 2016(06)
硕士论文
[1]小反刍兽疫病毒F蛋白与H蛋白相互作用及F蛋白免疫原性研究[D]. 杨香芳.甘肃农业大学 2013
[2]小反刍兽疫病毒F、H基因的核酸疫苗及N蛋白的原核表达研究[D]. 阮洋.吉林农业大学 2011
[3]含塞姆利基森林病毒复制子的HIV多表位核酸疫苗的构建与表达[D]. 付延军.延边大学 2007
本文编号：3292171
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