猪MITF基因转录调控区域克隆及活性分析

发布时间：2021-07-20 19:42

　　本试验用基因克隆、测序、.双荧光素酶报告系统和干扰RNA等方法,研究了猪MITF-M基因的转录调控区域序列及其转录活性与功能,得到了如下结果：1、从藏猪基因组中调取了含有MITF基因的scarffords,将其作为参考序列设计了3对相互重叠的引物,通过PCR克隆测序,首次获得猪MITF-M转录调控区约7.8kb的序列。2、根据测序得到的MITF-M调控区序列设计引物,利用“巢式”PCR克隆转录调控区域片段,通过酶切、连接、转化,成功构建并验证了猪MITF-M基因转录调控区域的10段5’端缺失报告基因载体:PGL3-1140、PGL3-1397、PGL3-2470、PGL3-3487、 PGL3-3753、PGL3-5201、PGL3-5429、PGL3-6036、PGL3-6274、PGL3-6416。3、将所构建的10个载体转染到B16细胞,48小时后,利用双荧光素报告系统检测10个载体的荧光素酶活性,确定了MITF-M转录调控区存在两个重要核心区域,分别位于-2470-3487 bp的负调控区和-5429～-6036 bp的正调控区。4、利用转录因子预测软件JASPAR和干扰RNA... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：62 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
符号说明
1 文献综述
    1.1 小眼畸形相关转录因子(MITF)的发现
    1.2 MITF的结构与功能
    1.3 MITF的转录调控、转录后修饰和信号通路
    1.4 MITF调控的靶基因
    1.5 MITF与黑色素形成的关系
        1.5.1 MITF突变与黑色素的缺失
        1.5.2 MITF调控黑色素的形成
    1.7 MITF-M与黑色素细胞的生存
    1.8 MITF与动物毛色的关系
2 研究内容与目的意义
3 材料与方法
    3.1 试验材料
        3.1.1 菌株和载体
        3.1.2 试验样品和细胞系
        3.1.3 主要仪器与设备
        3.1.4 主要试剂
        3.1.5 试剂的配制
        3.1.6 生物信息学网站和分析软件
    3.2 试验方法
        3.2.1 猪MITF-M转录调控区域的克隆及重组表达质粒的构建
        3.2.2 组织基因组DNA提取
        3.2.3 PCR、酶切产物回收与连接
        3.2.4 感受态细胞的制备
        3.2.5 重组质粒的鉴定
        3.2.6 质粒提取
        3.2.7 细胞培养
        3.2.8 细胞转染
        3.2.9 荧光素酶活性测定
        3.2.10 B16细胞RNA提取
        3.2.11 cDNA的制备
        3.2.12 定量PCR
4 结果与分析
    4.1 基因组DNA提取结果
    4.2 猪MITF-M基因5'端调控序列克隆与测序
    4.3 猪MITF-M转录调控区域序列分析
        4.3.1 猪MITF-M基因5'端调控序列保守性分析
        4.3.2 转录调控区域核心活性区的预测
        4.3.3 CpG岛的预测
        4.3.4 MITF-M转录调控区域MEME结构分析
    4.4 猪MITF-M转录调控区域重组载体构建结果
    4.5 MITF-M转录调控区域5'缺失载体转染及荧光素活性检测
    4.6 MITF-M转录调控区域转录因子预测
    4.7 KLF4调控MITF-M转录调控区域的转录活性
5. 讨论
    5.1 猪MITF-M调控区域序列的获得
    5.2 缺失片段的选择和克隆
    5.3 甲基化对转录活性的影响
    5.4 转录因子对MITF-M转录调控区域活性的影响
    5.5 KLF4对MITF-M转录活性的影响
6 结论
参考文献
致谢
附件1：猪MITF-M基因转录调控区序列
附件2：攻读学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]Mitf-M在羊驼皮肤组织的表达与序列分析及免疫组织化学定位[J]. 朱芷葳,贺俊平,于秀菊,程志学,董常生.  中国农业科学. 2012(04)
[2]猪Mitf基因的比较基因组学和进化分析[J]. 艾华水,胡小芬,周利华.  生物技术通报. 2010(07)
[3]KLF4在正常生理活动与肿瘤中的作用[J]. 吴钊,王子卫.  癌变·畸变·突变. 2010(03)



本文编号：3293463