四川省猪嵴病毒病流行病学调查及间接ELISA抗体检测方法的建立

发布时间：2021-07-21 10:07

　　猪嵴病毒（Porcine kobuvirus）是微小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）嵴病毒属（Kobuvirus）成员。2008年,匈牙利学者首次报道在无临床症状表现的猪粪便中发现猪嵴病毒；2009年,在中国猪群中也检出了猪嵴病毒。自此之后,多个国家报道在猪群中检测到猪嵴病毒,包括泰国、日本、韩国、荷兰、巴西、西班牙、意大利、东非等。猪嵴病毒是一种具有传染性、在世界范围内广泛分布的新型病毒,在腹泻猪中有较高检出率,认为可能是猪腹泻的病原,但鉴于其在没有腹泻的猪群中也普遍存在,且目前尚未能实现体外分离培养,需要更多的研究来阐明其生物学特性及病原特性。本研究旨在对四川地区猪嵴病毒病流行情况进行调查,并对四川株猪嵴病毒VP1基因分子流行病学特点进行分析；VP1蛋白是嵴病毒暴露在最外面的结构蛋白,是嵴病毒的优势免疫蛋白,本研究通过大肠杆菌表达系统,表达猪嵴病毒VP1蛋白优势抗原表位区,利用纯化的重组蛋白建立一种检测猪血清中猪嵴病毒抗体的间接ELISA方法,为今后猪嵴病毒血清学诊断方法的研究奠定基础。本研究在2011-2012年从四川猪场中收集了163份猪粪便和肠道组织样品,其中1... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：79 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略词表
第一部分 文献综述
    1 嵴病毒的发现及生物学分类
    2 嵴病毒形态学结构和基因组结构
    3 嵴病毒基因组及其编码的蛋白质
    4 嵴病毒生物学特性
    5 嵴病毒流行病学
        5.1 人爱知病毒
        5.2 牛嵴病毒
        5.3 猪嵴病毒
    6 嵴病毒的实验室诊断
    本研究的目的与意义
第二部分 实验部分
    第一章 2011-2012年四川地区猪群猪嵴病毒感染情况.调查及猪嵴病毒VP1基因分子流行病学调查分析
        1 材料与试剂
            1.1 实验试剂
            1.2 实验仪器
            1.3 溶液及配制
            1.4 临床样品
            1.5 菌株
        2 实验方法
            2.1 引物合成
            2.2 样品的处理及总RNA提取
            2.3 反转录制备cDNA
            2.4 猪嵴病毒PCR检测
            2.5 生物统计学分析
            2.6 猪嵴病毒VP1基因扩增
            2.7 目的DNA片段的回收
            2.8 分子克隆
            2.9 猪嵴病毒多聚蛋白基因的基因多样性分析
            2.10 序列相似性分析和系统进化树分析
            2.11 重组分析
        3 实验结果
            3.1 猪嵴病毒3D基因的RT-PCR扩增
            3.2 猪嵴病毒抗原RT-PCR检测结果
            3.3 生物统计分析结果
            3.4 猪嵴病毒VP1基因扩增结果
            3.5 猪嵴病毒多聚蛋白基因的基因多样性分析结果
            3.6 系统进化树分析结果
            3.7 重组分析结果
        4 讨论分析
    第二章 猪嵴病毒VP1基因生物信息学分析与蛋白优势抗原表位区域的原核表达
        1 材料和试剂
            1.1 实验试剂
            1.2 实验器材
            1.3 溶液及配置
            1.4 菌种及载体
            1.5 阳性血清和阴性血清
        2 实验方法
            2.1 猪嵴病毒VP1基因生物信息学分析
            2.2 猪嵴病毒VP1基因优势抗原表位密码子优化与基因合成
            2.3 猪嵴病毒VP1蛋白优势抗原表位区PCR引物设计与合成
            2.4 猪嵴病毒VP1蛋白优势抗原表位PCR扩增
            2.5 猪嵴病毒VP1蛋白优势抗原表位克隆测序与鉴定
            2.6 猪嵴病毒VP1蛋白优势抗原表位原核表达载体的构建
            2.7 BL21(DE3)-pET32-VP1原核表达菌的诱导表达与表达条件优化
            2.8 重组蛋白的大量表达与纯化
            2.9 Western-blot检测
        3 实验结果
            3.1 猪嵴病毒VP1基因生物信息学分析结果
            3.2 密码子优化结果
            3.3 猪嵴病毒VP1蛋白优势抗原表位PCR扩增结果
            3.4 猪嵴病毒VP1蛋白优势抗原表位TA克隆与鉴定结果
            3.5 BL21(DE3)-pET32-VP1原核表达菌菌株构建
            3.6 BL21(DE3)-pET32-VP1原核表达菌的诱导表达
            3.7 BL21(DE3)-pET32-VP1原核表达条件优化结果
            3.8 BL21(DE3)-PET32-VP1原核表达重组蛋白可溶性检测
            3.9 BL21(DE3)-pET32-VP1原核表达重组蛋白的纯化
            3.10 重组表达蛋白Western-blot检测结果
        4 讨论分析
    第三章 猪嵴病毒抗体检测间接ELISA方法的建立与初步应用
        1 材料和试剂
            1.1 实验试剂
            1.2 实验器材
            1.3 溶液及配置
            1.4 血清样品
        2 实验方法
            2.1 纯化重组蛋白浓度测定
            2.2 间接ELISA方法的基本操作程序
            2.3 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定
            2.4 抗原包被条件的确定
            2.5 封闭液的选择以及封闭时间的确定
            2.6 血清样品最适作用时间的确定
            2.7 酶标二抗工作浓度和作用时间的优化
            2.8 底物作用时间的优化
            2.9 临界值的确定
            2.10 特异性实验
            2.11 重复性实验
            2.12 临床样本的检测
        3 实验结果
            3.1 纯化重组蛋白浓度测定结果
            3.2 间接ELISA检测方法的建立
            3.3 临床样本的检测
        4 讨论分析
结论
参考文献
致谢
攻读硕士学位之间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]河南地区猪嵴病毒分子检测和VP1基因遗传进化分析[J]. 姬郭彪,赵军,周峰,魏亚鹏,常洪涛,郑逢梅,王川庆.  中国预防兽医学报. 2014(01)
[2]猪嵴病毒441株3D基因的克隆及序列分析[J]. 王恩丽,兰喜,刘伟,杨彬,柳纪省,马小军.  生物技术通报. 2013(11)
[3]猪Kobu病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 向宇,薛青红,印春生,支海兵.  中国兽药杂志. 2013(08)
[4]一起仔猪流行性腹泻的诊治[J]. 张芳,徐兆强.  养殖与饲料. 2013(08)
[5]2012年猪嵴病毒流行病学调查及3D基因的遗传变异分析[J]. 张莎,石达,陈建飞,时红艳,张鑫,刘孝珍,刘随新,王璐,陈洪岩,冯力.  中国预防兽医学报. 2013(02)
[6]猪嵴病毒RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 张文波,冷闯,段俊,邓舜洲.  中国畜牧兽医. 2013(01)
[7]猪嵴病毒VP1基因的克隆及生物信息学分析[J]. 陈蕾,朱玲,李淞,周远成,徐志文.  中国兽医科学. 2012(12)
[8]嵴病毒（Kobuvirus）研究进展[J]. 杨德全,葛菲菲,鞠厚斌,刘健,王建,周锦萍.  中国预防兽医学报. 2012(12)
[9]2011～2012年猪腹泻疫情中6种病毒在乳猪肠道的感染检测[J]. 韩庆彦,兰喜,周峰,尚立宏,王佳,姚奕蕾,车小蛟,王子坚,贺奋义.  国外畜牧学(猪与禽). 2012(09)
[10]动物嵴病毒病原特点及检测[J]. 代洪波,李淞,周远成,朱玲,徐志文.  病毒学报. 2012(05)

硕士论文
[1]猪嵴病毒流行病学调查及CH/HZ/2011株全基因序列分析[D]. 张莎.东北农业大学 2013
[2]河南猪嵴病毒分子流行病学调查、全基因序列分析、VP1蛋白表达及其初步应用[D]. 姬郭彪.河南农业大学 2013
[3]猪嵴病毒VP1基因克隆与表达及抗体检测ELISA方法的建立[D]. 田野.扬州大学 2013



本文编号：3294820