山羊乳腺分泌上皮细胞单克隆培养及miR-200c对ACACA基因靶向调控研究
发布时间：2021-07-21 22:04
乳腺分泌上皮细胞是乳腺中唯一能够合成、分泌乳汁的细胞，体外培养的具有分泌功能的乳腺分泌上皮细胞是研究乳腺泌乳功能的重要工具。本研究通过活体采集崂山奶山羊乳腺组织，利用组织块贴壁法获得原代乳腺上皮细胞，纯化后通过显微操作法对乳腺上皮细胞进行单克隆培养，并通过形态观察、生长曲线绘制、广谱角蛋白和波形蛋白免疫荧光染色、相关基因的RT-PCR等方法对单克隆细胞系进行鉴定，以获得彻底纯化的奶山羊乳腺分泌上皮细胞系。以崂山奶山羊不同泌乳时期乳腺组织miRNA高通量测序数据为基础，分析miR-200c与ACACA基因的靶向关系。以崂山奶山羊单克隆乳腺分泌上皮细胞为试验材料，通过载体构建和细胞转染，利用qRT-PCR、双荧光素酶报告基因系统及Western-blot等方法验证miR-200c与ACACA基因的靶向关系。主要研究结果如下：（1）采用组织块培养法分离得到了崂山奶山羊原代乳腺上皮细胞，初步纯化后，利用显微操作法，获得并扩繁了乳腺分泌上皮细胞的单克隆培养体系；（2）单细胞克隆培养获得的奶山羊乳腺分泌上皮细胞，形态整齐、生长旺盛，具有典型的上皮细胞形态特征和‘S’型细胞生长曲线，广谱角蛋白和波形...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
乳腺上皮细胞系谱（Hennighausenetal.，2005）
研究人员对乳腺细胞的增殖分化以及凋亡进行了详细。乳腺上皮的增殖、分化和衰退伴随着成年动物生殖和泌乳发育阶段受上皮和间质的相互作用以及全身和局部的类固d et al.，2012），也受到自然环境因素的影响。育始于胚胎期，至出生时已经基本成型。青春期前，乳腺和春期时，乳腺的导管系统才开始显著生长。此时末端乳芽渐侵入脂肪垫，产生复杂的导管系统，直至充满整个脂肪产生的雌激素和孕酮促进并加速了导管系统的发育。性成初级和次级导管，伴随着发情周期的变化，导管也经历周期素环境的改变刺激了细胞的增殖和腺泡的形成，并于妊娠泌乳期，腺泡完全成熟，腔上皮细胞开始合成并分泌乳汁体在经历凋亡和重塑后逐渐恢复到妊娠前的状态。以上发
3.1 乳腺分泌上皮细胞系的建立3.1.1 原代乳腺上皮细胞的培养3.1.1.1 原代乳腺上皮细胞的分离组织块培养法获得原代乳腺上皮细胞的时间长短不一，从接种至第一次传代的周约为 10 天。乳腺组织小块接种 24 h 后进行第一次观察，发现组织块周围出现晕圈，有颗粒状物质游出（图 3-1A）；4 d 后，组织块周围游离出少量细胞，多为成纤维样胞（图 3-1B），同时也可见少量上皮样细胞（图 3-1C）；8 d 后大部分组织块周围长出量的细胞，排列紧密，形态近似圆形，且多为上皮样细胞（图 3-1D）。继续培养，待胞汇合率为 90%左右时除去组织块并消化、传代。
【参考文献】：
期刊论文
[1]miR-200家族在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达分析[J]. 张犁苹,罗军,林先滋,朱江江,石恒波,史怀平,李君. 畜牧兽医学报. 2013(06)
[2]单细胞技术在干细胞研究中的应用[J]. 董芳,袁卫平,程涛. 中国细胞生物学学报. 2013(01)
[3]miR-200a对奶山羊乳腺上皮细胞乳脂合成相关基因mRNA表达的影响[J]. 林先滋,罗军,张犁苹,朱江江,石恒波,苟德明. 畜牧兽医学报. 2012(07)
[4]调控山羊乳腺脂肪酸代谢miRNAs筛选及相关pri-miRNAs克隆验证[J]. 林先滋,罗军,张犁苹,赵旺生,王维,苟德明. 农业生物技术学报. 2012(06)
[5]组织块再移法分离培养奶山羊乳腺上皮细胞[J]. 陈秋菊,王韵斐,崔易虹,朱广琴,宋宇轩,曹斌云. 中国兽医学报. 2012(02)
[6]崂山奶山羊乙酰辅酶A羧化酶α基因（ACACA）多态性及其与泌乳性状的相关分析[J]. 王金凤,王建民,王桂芝,陈珊珊,王勇,赵金山,王建华,程明. 农业生物技术学报. 2011(06)
[7]奶山羊乳腺上皮细胞的分离、培养及鉴定[J]. 王桢,罗军,王伟,赵旺生,林先滋. 生物工程学报. 2010(08)
[8]牛乳腺上皮细胞体外培养体系研究进展[J]. 宋亚男,陈志伟,刘东武. 生命科学仪器. 2008(09)
[9]山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆的制备与鉴定[J]. 邵桃玉,韩庆广,李融,赵国琦. 上海畜牧兽医通讯. 2008(04)
[10]单细胞显微操作法克隆技术[J]. 王雪岷. 解剖学杂志. 2006(06)
硕士论文
[1]崂山奶山羊ACACA和SCD基因多态性与泌乳性状的关联分析[D]. 王金凤.山东农业大学 2011
本文编号：3295847
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
乳腺上皮细胞系谱（Hennighausenetal.，2005）
研究人员对乳腺细胞的增殖分化以及凋亡进行了详细。乳腺上皮的增殖、分化和衰退伴随着成年动物生殖和泌乳发育阶段受上皮和间质的相互作用以及全身和局部的类固d et al.，2012），也受到自然环境因素的影响。育始于胚胎期，至出生时已经基本成型。青春期前，乳腺和春期时，乳腺的导管系统才开始显著生长。此时末端乳芽渐侵入脂肪垫，产生复杂的导管系统，直至充满整个脂肪产生的雌激素和孕酮促进并加速了导管系统的发育。性成初级和次级导管，伴随着发情周期的变化，导管也经历周期素环境的改变刺激了细胞的增殖和腺泡的形成，并于妊娠泌乳期，腺泡完全成熟，腔上皮细胞开始合成并分泌乳汁体在经历凋亡和重塑后逐渐恢复到妊娠前的状态。以上发
3.1 乳腺分泌上皮细胞系的建立3.1.1 原代乳腺上皮细胞的培养3.1.1.1 原代乳腺上皮细胞的分离组织块培养法获得原代乳腺上皮细胞的时间长短不一，从接种至第一次传代的周约为 10 天。乳腺组织小块接种 24 h 后进行第一次观察，发现组织块周围出现晕圈，有颗粒状物质游出（图 3-1A）；4 d 后，组织块周围游离出少量细胞，多为成纤维样胞（图 3-1B），同时也可见少量上皮样细胞（图 3-1C）；8 d 后大部分组织块周围长出量的细胞，排列紧密，形态近似圆形，且多为上皮样细胞（图 3-1D）。继续培养，待胞汇合率为 90%左右时除去组织块并消化、传代。
【参考文献】：
期刊论文
[1]miR-200家族在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达分析[J]. 张犁苹,罗军,林先滋,朱江江,石恒波,史怀平,李君. 畜牧兽医学报. 2013(06)
[2]单细胞技术在干细胞研究中的应用[J]. 董芳,袁卫平,程涛. 中国细胞生物学学报. 2013(01)
[3]miR-200a对奶山羊乳腺上皮细胞乳脂合成相关基因mRNA表达的影响[J]. 林先滋,罗军,张犁苹,朱江江,石恒波,苟德明. 畜牧兽医学报. 2012(07)
[4]调控山羊乳腺脂肪酸代谢miRNAs筛选及相关pri-miRNAs克隆验证[J]. 林先滋,罗军,张犁苹,赵旺生,王维,苟德明. 农业生物技术学报. 2012(06)
[5]组织块再移法分离培养奶山羊乳腺上皮细胞[J]. 陈秋菊,王韵斐,崔易虹,朱广琴,宋宇轩,曹斌云. 中国兽医学报. 2012(02)
[6]崂山奶山羊乙酰辅酶A羧化酶α基因（ACACA）多态性及其与泌乳性状的相关分析[J]. 王金凤,王建民,王桂芝,陈珊珊,王勇,赵金山,王建华,程明. 农业生物技术学报. 2011(06)
[7]奶山羊乳腺上皮细胞的分离、培养及鉴定[J]. 王桢,罗军,王伟,赵旺生,林先滋. 生物工程学报. 2010(08)
[8]牛乳腺上皮细胞体外培养体系研究进展[J]. 宋亚男,陈志伟,刘东武. 生命科学仪器. 2008(09)
[9]山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆的制备与鉴定[J]. 邵桃玉,韩庆广,李融,赵国琦. 上海畜牧兽医通讯. 2008(04)
[10]单细胞显微操作法克隆技术[J]. 王雪岷. 解剖学杂志. 2006(06)
硕士论文
[1]崂山奶山羊ACACA和SCD基因多态性与泌乳性状的关联分析[D]. 王金凤.山东农业大学 2011
本文编号：3295847
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