泰安及周边地区猪增生性肠炎感染情况调查和胞内劳森菌培养方法建立
发布时间：2021-07-23 08:47
猪增生性肠炎以患猪回肠和结肠隐窝内未成熟的肠腺上皮细胞发生腺瘤样的增生、肠黏膜上皮细胞异常增多和肠管增厚为特征,可伴发腹泻。急性型较少,多见慢性型和亚临床型,常常在屠宰时才发现,最明显的特征就是患猪生长迟缓,体重较正常猪要轻得多。胞内劳森菌是该病的致病菌,在形态上与弯曲菌相似,菌体呈杆状,两端尖锐或者钝圆,长度约1.251.75μm,宽度约0.250.43μm,具有三层外膜,革兰氏染色阴性。该菌的培养条件十分苛刻,在目前所有在用的培养基包括鸡胚均不能生长,只能用特殊的肠细胞系来进行培养,比如鼠肠上皮细胞IEC-18、猪肠上皮细胞IPEC-J2和小鼠成纤维细胞McCoy,或者使用分离自宿主的肠道原代细胞。感染该菌的细胞不见明显的病变,因此难以直观地观察到该菌的感染。更苛刻的条件是需要保持培养环境8%的低氧状态,绝对无氧和正常供氧都不利于该菌的生长。胞内劳森菌是一种对抗生素敏感的细菌,日常养殖时使用药物预防便可抑制该菌生长繁殖,达到预防该病的效果。现在国际上因食品安全等原因推崇无抗养殖模式,国内也大力推行无抗养殖,目前虽有市售疫苗,但很少被应用。...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
胞内劳森菌研究的重要要里程事件Fig1-1.ImportantmilestonesinthestudyofLawsoniaintracellularis
泰安及周边地区猪增生性肠炎感染情况调查和胞内劳森菌培养方法建立6图1-2.胞内劳森菌感染肠上皮细胞的模式图Fig1-2.PatternofLawsoniaintracellularisinfectionofintestinalepithelialcells胞内劳森氏菌是在细胞内增殖的，以二分裂的形式进行复制并在细胞间扩散(DriemeierD.etal.,2002)。细胞增生仅限于被细菌感染的细胞，并且细胞增生区位于正常上皮之间，感染后的细胞呈现高速率分裂，有丝分裂加强，细胞数目可增加至正常细胞数倍之多。当病变发展严重时，细胞受细菌刺激而高速增殖则不再持续。有研究发现与未感染胞内劳森氏菌的肠上皮细胞相比，感染细胞的G1期相关基因（RhoA、RhoB和RhoGTPase）转录、蛋白合成均被明显激活。细胞周期G1期的mRNA转录和蛋白质的合成非常活跃，用以准备宿主细胞的后续分裂。Notch信号通路和Wnt/β-连环蛋白通路也可能与未成熟隐窝上皮细胞增殖有关(BengtssonR.J.etal,2017)。另外，在感染的细胞中与营养获取相关的基因表达下调，导致肠道内的营养物质摄取不足，这可能是导致腹泻的原因之一(OhYS.etal.,2010；JacobsonM.etal.,2011；SmithSH.etal.,2014;VannucciFA.etal.,2013)。1.5猪增生性肠炎的诊断与检测初步的诊断主要依据流行病学、临床症状和眼观病变，但是很难与其他肠道疾病进行区分，不能确诊。在初步诊断的基础上，可以通过病理组织学、细菌学、血清学和分子生物学检测等技术手段来进行实验室诊断。1.5.1病理组织学检查病理组织学检查较为简单，HE染色可以看到由病菌感染造成的组织增生和组织损伤，但是对细菌检测的敏感性较低，特别是镜检没有发现黏膜增生的病例。而取病变组织做切片，用WS镀银法染色；或取病变黏膜做抹片，用改良的Ziehl-Neelsen法染色可以观察到肠腺细胞内是否有胞内寄生菌的存
泰安及周边地区猪增生性肠炎感染情况调查和胞内劳森菌培养方法建立14取相应数量的样本，屠宰场的生猪来源主要是鲁中及鲁西的部分地市，所有肠道样本均来自正常月龄屠宰生猪。为尽量避免样品来源过于集中，采样时间通常间隔数日。对采集来的肠道样品进行清洗、称重、研磨与核酸提取处理，并分别统计各个样品的来源地。对PCR检测阳性的样本要观察并记录小肠的肠壁增生情况及内容物情况，用PBS冲洗小肠内壁，将其浸泡在4%的甲醛溶液中固定，用于做组织病理学检测。粪便样本的采集同样采用随机抽取的方法，在每个采样地区选择3家互不临近的养殖场，在每个圈舍内随机采取4头猪的肛门拭子进行核酸提取处理，所有粪便样本均来自生长育肥猪,两种样本的覆盖地区见图2-1。图2-1.样品采集覆盖区域Figure2-1.Samplecoverage2.2.1.2常规PCR引物设计根据GenBank上已公布的胞内劳森氏菌全序列（登录号：AM180252），在aspA基因保守区靶点上设计一对特异性引物，片段大小为319bp，序列信息见表2-5,交由上海生工生物合成。2.2.1.3猪肠道组织DNA提取采用市售的组织基因组DNA提取Kit，携带的胞内劳森菌基因组DNA可同时提取，步骤如下：（1）将每份肠管分别切成碎块放入已灭菌的提前加入无菌PBS的2ml预冷离心管中，再放入酒精浸泡灭菌后预冷的5mm不锈钢研磨珠，用研磨机研磨2min，此时已无大组织块;（2）将上述离心管置于高速离心机内,9000rmp离心2min使组织沉淀；（3）取50mg左右沉淀的组织碎块，放入2ml的PE离心管；：肠道样本：粪便样本
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪增生性肠炎诊断技术研究进展[J]. 郑新添,杨小燕. 中国畜牧兽医. 2011(04)
[2]猪增生性肠炎的致病机理及流行病学最新进展[J]. 李龙. 养猪. 2011(02)
[3]猪增生性肠炎的病原特性研究进展[J]. 刘佩红,王建,张维谊. 上海畜牧兽医通讯. 2005(01)
[4]猪增生性肠炎研究进展[J]. 俞道进. 动物医学进展. 2001(03)
硕士论文
[1]猪胞内劳森菌检测方法的建立及其培养方法的初探[D]. 田城.南京农业大学 2012
本文编号：3298974
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
胞内劳森菌研究的重要要里程事件Fig1-1.ImportantmilestonesinthestudyofLawsoniaintracellularis
泰安及周边地区猪增生性肠炎感染情况调查和胞内劳森菌培养方法建立6图1-2.胞内劳森菌感染肠上皮细胞的模式图Fig1-2.PatternofLawsoniaintracellularisinfectionofintestinalepithelialcells胞内劳森氏菌是在细胞内增殖的，以二分裂的形式进行复制并在细胞间扩散(DriemeierD.etal.,2002)。细胞增生仅限于被细菌感染的细胞，并且细胞增生区位于正常上皮之间，感染后的细胞呈现高速率分裂，有丝分裂加强，细胞数目可增加至正常细胞数倍之多。当病变发展严重时，细胞受细菌刺激而高速增殖则不再持续。有研究发现与未感染胞内劳森氏菌的肠上皮细胞相比，感染细胞的G1期相关基因（RhoA、RhoB和RhoGTPase）转录、蛋白合成均被明显激活。细胞周期G1期的mRNA转录和蛋白质的合成非常活跃，用以准备宿主细胞的后续分裂。Notch信号通路和Wnt/β-连环蛋白通路也可能与未成熟隐窝上皮细胞增殖有关(BengtssonR.J.etal,2017)。另外，在感染的细胞中与营养获取相关的基因表达下调，导致肠道内的营养物质摄取不足，这可能是导致腹泻的原因之一(OhYS.etal.,2010；JacobsonM.etal.,2011；SmithSH.etal.,2014;VannucciFA.etal.,2013)。1.5猪增生性肠炎的诊断与检测初步的诊断主要依据流行病学、临床症状和眼观病变，但是很难与其他肠道疾病进行区分，不能确诊。在初步诊断的基础上，可以通过病理组织学、细菌学、血清学和分子生物学检测等技术手段来进行实验室诊断。1.5.1病理组织学检查病理组织学检查较为简单，HE染色可以看到由病菌感染造成的组织增生和组织损伤，但是对细菌检测的敏感性较低，特别是镜检没有发现黏膜增生的病例。而取病变组织做切片，用WS镀银法染色；或取病变黏膜做抹片，用改良的Ziehl-Neelsen法染色可以观察到肠腺细胞内是否有胞内寄生菌的存
泰安及周边地区猪增生性肠炎感染情况调查和胞内劳森菌培养方法建立14取相应数量的样本，屠宰场的生猪来源主要是鲁中及鲁西的部分地市，所有肠道样本均来自正常月龄屠宰生猪。为尽量避免样品来源过于集中，采样时间通常间隔数日。对采集来的肠道样品进行清洗、称重、研磨与核酸提取处理，并分别统计各个样品的来源地。对PCR检测阳性的样本要观察并记录小肠的肠壁增生情况及内容物情况，用PBS冲洗小肠内壁，将其浸泡在4%的甲醛溶液中固定，用于做组织病理学检测。粪便样本的采集同样采用随机抽取的方法，在每个采样地区选择3家互不临近的养殖场，在每个圈舍内随机采取4头猪的肛门拭子进行核酸提取处理，所有粪便样本均来自生长育肥猪,两种样本的覆盖地区见图2-1。图2-1.样品采集覆盖区域Figure2-1.Samplecoverage2.2.1.2常规PCR引物设计根据GenBank上已公布的胞内劳森氏菌全序列（登录号：AM180252），在aspA基因保守区靶点上设计一对特异性引物，片段大小为319bp，序列信息见表2-5,交由上海生工生物合成。2.2.1.3猪肠道组织DNA提取采用市售的组织基因组DNA提取Kit，携带的胞内劳森菌基因组DNA可同时提取，步骤如下：（1）将每份肠管分别切成碎块放入已灭菌的提前加入无菌PBS的2ml预冷离心管中，再放入酒精浸泡灭菌后预冷的5mm不锈钢研磨珠，用研磨机研磨2min，此时已无大组织块;（2）将上述离心管置于高速离心机内,9000rmp离心2min使组织沉淀；（3）取50mg左右沉淀的组织碎块，放入2ml的PE离心管；：肠道样本：粪便样本
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪增生性肠炎诊断技术研究进展[J]. 郑新添,杨小燕. 中国畜牧兽医. 2011(04)
[2]猪增生性肠炎的致病机理及流行病学最新进展[J]. 李龙. 养猪. 2011(02)
[3]猪增生性肠炎的病原特性研究进展[J]. 刘佩红,王建,张维谊. 上海畜牧兽医通讯. 2005(01)
[4]猪增生性肠炎研究进展[J]. 俞道进. 动物医学进展. 2001(03)
硕士论文
[1]猪胞内劳森菌检测方法的建立及其培养方法的初探[D]. 田城.南京农业大学 2012
本文编号：3298974
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