绵羊肺腺瘤病毒受体hyal-2的原核表达及其多克隆抗体制备
发布时间：2021-07-23 22:40
目的：克隆绵羊肺腺瘤病毒受体hval-2基因全长,将其重组入原核表达载体中,构建重组质粒,进而转化到BL21（DE3）大肠杆菌中,进行诱导表达,利用亲和层析的方法纯化出Hyal-2蛋白,制备hyal-2的多克隆抗体,为进一步鉴定JSRV感染的组织细胞,探究JSRV的组织嗜性奠定基础.方法：本研究根据已报道的hval-2基因序列,经primer5.0软件设计一对特异性的引物序列,利用PCR方法扩增hval-2基因序列,并将其重组入pGEX-4T-1原核表达载体中,构建pGEX-4T-1-hyal-2重组质粒,进行菌液PCR及测序,鉴定重组质粒构建的正确性。将其转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导后进行10%SDS-PAGE电泳分析,检测融合蛋白的表达情况,经Western blotting验证融合蛋白的表达。为了使GST-Hyal-2融合蛋白大量、稳定、高效地表达,本试验分别对重组菌表达GST-Hyal-2融合蛋白的IPTG诱导浓度、诱导时间、温度进行了优化,摸索最佳的表达条件。进而利用谷胱甘肽亲和层析的方法对目的蛋白进行亲和纯化,将纯化后的目的蛋白免疫家兔,制备Hval-...
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PGEX-4T-1载体图谱
内蒙古农业大学硕士学位论文 21_1 M■ top.2000i1000750500250100图2. 基因PCR扩増产物电泳结果Fig 2. PCR amplification results of hyal-2 gene注：1. PCR 扩增产物；M.DL2000 DNA Marker。2.3.2菌液PCR检测结果将重组质粒转化入宿主菌DH5a大肠杆菌，倒置培养后，随机挑取8个单克隆菌落进行菌液PCR鉴定，其中除7号为阴性外，其余均为阳性（如图3所示），菌液PCR鉴定为阳性的2、6号菌液送测序鉴定。！1 2 3 4. 5 6 Y 8 Mm————图3.菌液PCR鉴定结果Fig 3. Bacteria iclentincation results of PCR注：1?8.随机挑取的8个申.Si落2.3.3 /7>^3/-^?基因的序列分析利用DNAStar对测序结果进行分析，,显示/7737-2基因全长为1431 bp,通过Blast序列比对分析发现与己报道的力/ai-2基因（JX231101.1)的核苷酸同源性为100%，应用DNAStar生物信息学软件分析发现hya.l」l基因编码476个氨基酸,蛋白分子量为54. 2 ku，测序结果及编码的氧基酸序列如下图：I
图3.菌液PCR鉴定结果Fig 3. Bacteria iclentincation results of PCR注：1?8.随机挑取的8个申.Si落3 /7>^3/-^?基因的序列分析
【参考文献】：
期刊论文
[1]绵羊肺腺瘤病毒实时荧光PCR检测方法的建立[J]. 骆丹,路义鑫,徐义刚,付丽君,张子群. 中国预防兽医学报. 2013(06)
[2]绵羊肺腺瘤LAMP快速诊断方法的初步建立（英文）[J]. 刘霄卉,于立新,罗军荣,周艳喜,刘畅,幺宏强,周建华,马学恩. 内蒙古农业大学学报(自然科学版). 2013(02)
[3]绵羊肺腺瘤病毒与绵羊肺炎支原体双重PCR检测方法的建立及应用[J]. 王景儒,张树清. 黑龙江畜牧兽医. 2013(07)
[4]鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因密码子的优化及其在大肠杆菌中的表达[J]. 潘群兴,朱向东,欧阳伟,王晓丽,夏兴霞,毕振威,诸玉梅,董晨红,王永山. 中国兽医科学. 2013(03)
[5]环介导等温扩增技术在临床上的应用[J]. 任春阳,田甜,田杰. 中国微生态学杂志. 2013(01)
[6]功能性包涵体的研究进展[J]. 罗莉,何勇智,张勇侠,王明蓉. 中国生物工程杂志. 2013(01)
[7]绵羊透明质酸酶-2的真核表达及鉴定[J]. 张月梅,么宏强,斯日古楞,马学恩. 中国畜牧兽医. 2012(11)
[8]狂犬病病毒糖蛋白膜外区密码子优化、原核表达及纯化[J]. 鞠美芳,殷相平,柳纪省. 中国人兽共患病学报. 2012(09)
[9]芽孢杆菌β-折叠桶植酸酶的原核可溶性表达优化及包涵体复性研究[J]. 李倩倩,李中媛,冯舵,黄火清,韩翠晓,杨培龙,姚斌,高伟. 中国生物工程杂志. 2012(08)
[10]兰州地区绵羊肺腺瘤病的诊断及病理学研究[J]. 鲁延刚,相猛,贾宁,潘虹,李栋,宁明刚. 甘肃农业大学学报. 2012(02)
博士论文
[1]enJSRV及其受体HYAL2在蒙古绵羊子宫和胚胎中的表达与定位[D]. 徐萌杰.内蒙古农业大学 2011
[2]JSRV表面蛋白抗原表位的筛选及检测试剂盒的制备[D]. 刘霄卉.内蒙古农业大学 2011
[3]绵羊肺腺瘤病自然病例和人工感染病例的临床病理学及分子病理学研究[D]. 么宏强.内蒙古农业大学 2006
硕士论文
[1]人胎盘泌乳素的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备[D]. 曲影.吉林大学 2013
[2]绵羊肺腺瘤病毒的分子生物学技术检测[D]. 赵泽赟.内蒙古农业大学 2011
[3]绵羊肺腺瘤病的病理组织学研究[D]. 郑秉武.内蒙古农业大学 2006
本文编号：3300176
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PGEX-4T-1载体图谱
内蒙古农业大学硕士学位论文 21_1 M■ top.2000i1000750500250100图2. 基因PCR扩増产物电泳结果Fig 2. PCR amplification results of hyal-2 gene注：1. PCR 扩增产物；M.DL2000 DNA Marker。2.3.2菌液PCR检测结果将重组质粒转化入宿主菌DH5a大肠杆菌，倒置培养后，随机挑取8个单克隆菌落进行菌液PCR鉴定，其中除7号为阴性外，其余均为阳性（如图3所示），菌液PCR鉴定为阳性的2、6号菌液送测序鉴定。！1 2 3 4. 5 6 Y 8 Mm————图3.菌液PCR鉴定结果Fig 3. Bacteria iclentincation results of PCR注：1?8.随机挑取的8个申.Si落2.3.3 /7>^3/-^?基因的序列分析利用DNAStar对测序结果进行分析，,显示/7737-2基因全长为1431 bp,通过Blast序列比对分析发现与己报道的力/ai-2基因（JX231101.1)的核苷酸同源性为100%，应用DNAStar生物信息学软件分析发现hya.l」l基因编码476个氨基酸,蛋白分子量为54. 2 ku，测序结果及编码的氧基酸序列如下图：I
图3.菌液PCR鉴定结果Fig 3. Bacteria iclentincation results of PCR注：1?8.随机挑取的8个申.Si落3 /7>^3/-^?基因的序列分析
【参考文献】：
期刊论文
[1]绵羊肺腺瘤病毒实时荧光PCR检测方法的建立[J]. 骆丹,路义鑫,徐义刚,付丽君,张子群. 中国预防兽医学报. 2013(06)
[2]绵羊肺腺瘤LAMP快速诊断方法的初步建立（英文）[J]. 刘霄卉,于立新,罗军荣,周艳喜,刘畅,幺宏强,周建华,马学恩. 内蒙古农业大学学报(自然科学版). 2013(02)
[3]绵羊肺腺瘤病毒与绵羊肺炎支原体双重PCR检测方法的建立及应用[J]. 王景儒,张树清. 黑龙江畜牧兽医. 2013(07)
[4]鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因密码子的优化及其在大肠杆菌中的表达[J]. 潘群兴,朱向东,欧阳伟,王晓丽,夏兴霞,毕振威,诸玉梅,董晨红,王永山. 中国兽医科学. 2013(03)
[5]环介导等温扩增技术在临床上的应用[J]. 任春阳,田甜,田杰. 中国微生态学杂志. 2013(01)
[6]功能性包涵体的研究进展[J]. 罗莉,何勇智,张勇侠,王明蓉. 中国生物工程杂志. 2013(01)
[7]绵羊透明质酸酶-2的真核表达及鉴定[J]. 张月梅,么宏强,斯日古楞,马学恩. 中国畜牧兽医. 2012(11)
[8]狂犬病病毒糖蛋白膜外区密码子优化、原核表达及纯化[J]. 鞠美芳,殷相平,柳纪省. 中国人兽共患病学报. 2012(09)
[9]芽孢杆菌β-折叠桶植酸酶的原核可溶性表达优化及包涵体复性研究[J]. 李倩倩,李中媛,冯舵,黄火清,韩翠晓,杨培龙,姚斌,高伟. 中国生物工程杂志. 2012(08)
[10]兰州地区绵羊肺腺瘤病的诊断及病理学研究[J]. 鲁延刚,相猛,贾宁,潘虹,李栋,宁明刚. 甘肃农业大学学报. 2012(02)
博士论文
[1]enJSRV及其受体HYAL2在蒙古绵羊子宫和胚胎中的表达与定位[D]. 徐萌杰.内蒙古农业大学 2011
[2]JSRV表面蛋白抗原表位的筛选及检测试剂盒的制备[D]. 刘霄卉.内蒙古农业大学 2011
[3]绵羊肺腺瘤病自然病例和人工感染病例的临床病理学及分子病理学研究[D]. 么宏强.内蒙古农业大学 2006
硕士论文
[1]人胎盘泌乳素的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备[D]. 曲影.吉林大学 2013
[2]绵羊肺腺瘤病毒的分子生物学技术检测[D]. 赵泽赟.内蒙古农业大学 2011
[3]绵羊肺腺瘤病的病理组织学研究[D]. 郑秉武.内蒙古农业大学 2006
本文编号：3300176
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