CPA-核酸试纸条快速检测霍乱弧菌方法的建立与优化
发布时间：2021-07-24 21:47
用交叉引物恒温扩增技术（Cross priming amplification,CPA）和核酸试纸条检测方法（Nucleic acid test strip detection methord）快速检测霍乱弧菌。根据霍乱弧菌的MDH基因序列设计特异性的引物和探针,通过对反应体系与反应条件进行优化,确立最佳反应体系,并将CPA方法与PCR法进行比较与评价。对霍乱弧菌的检测具有高度特异性,对霍乱弧菌的检出极限达到了6×102CFU/mL,高于PCR,而且具有较好的稳定性。交叉引物恒温扩增技术（Cross priming amplification,CPA）-核酸试纸条检测方法（Nucleic acid test strip detection methord）是一种特异、灵敏、快速、简便的霍乱弧菌的检测方法。
【文章来源】：生物技术通报. 2013,(07)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
可行性验证试纸条结果图
lyticus（ATCC17802）-Vibrioparahaemolyticus（ATCC27519）-Vibrioalginolyticus（ATCC33787）-Vibrioalginolyticus（ATCC17749）-Escherichiacoli（ATCC25922）-Staphylococcusaureus（ATCC25923）-2.4灵敏度试验结果用霍乱弧菌CPA-核酸试纸条快速检测方法的最佳反应体系扩增不同稀释度的霍乱弧菌（ATCC14035）（6×105CFU/mL），从试纸条结果看，随着模板浓度的降低，至稀释度为10-4时，没有出现检测线，说明此方法的检测灵敏度为起始菌液浓度的10-3即6×102CFU/mL。从电泳结果（图3）可以看出，随着模板浓度的降低，至稀释度为10-4时没有扩增产物，与试纸条的结果一致。1：10-1；2：10-2；3：10-3；4：10-4；5：阴性对照；M：marker图3灵敏度试验试纸条结果（A）以及灵敏度试验电泳结果（B）2.5普通PCR方法与CPA方法的比较结果用普通PCR方法扩增不同稀释度的霍乱弧菌（ATCC14035）（6×105CFU/mL）的DNA提取液，经琼脂糖凝胶电泳检测会出现588bp的扩增产物（图4）。结果表明，普通PCR方法在稀释度为10-3时就没有扩增产物即检测灵敏度为6×103CFU/mL。由此可以看出，CPA反应的灵敏度是普通PCR的10倍。3讨论传统分离鉴定法检测霍乱弧菌至少需要十几个小时才能完成，耗时较长。最近几年发展起来的荧光定量PCR方法、普通PCR方法等分子生物学方法由于受到仪器和设备的限制，虽然效果较好，但很难在基层大范围推广使用。因此需要建立一种灵敏度高、特异性强、简便、快速、便于在基层大规模推广的霍乱弧菌的检测技术。
2013年第7期171秦强等：CPA-核酸试纸条快速检测霍乱弧菌方法的建立与优化CPA方法是一种新颖的恒温扩增方法，具有很高的特异性和灵敏度，而且它是在恒温下进行扩增反应，仪器设备简单，只需能够保持恒定的温度即可。本研究把CPA方法与核酸试纸条检测方法结合起来，不需要通过电泳，可直接用核酸试纸条检测扩增结果，简便、快速，对于霍乱疫情的的应急诊断和监测具有重要意义。霍乱弧菌的mdh管家基因在不同的群型中具有高度的保守性，是作为靶基因的理想选择。本实验以mdh为靶基因，经过精确的引物设计、探针设计和对反应体系及反应条件的优化，建立了霍乱弧菌CPA-核酸试纸条快速检测方法。引物和探针的特异性和反应浓度对该方法的特异性和灵敏度起着决定性的作用，本试验根据目的序列的5个不同的区域设计了两对引物和两条探针，通过改变反应温度、BstDNAPolymerase的量、Betaine浓度、MgSO4浓度、引物和探针浓度进行反应体系的优化，最终确立了20μL的CPA的最佳反应体系，反应温度为63℃，60min即可完成反应，通过核酸试纸条可以直接判定反应结果，试验过程快速、简便。使用本研究的霍乱弧菌CPA-核酸试纸条快速检测方法检测实验室保存的霍乱弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌的结果与已知的菌株信息一致，证明该方法具有良好的特异性。将已知浓度的霍乱弧菌（ATCC14035）（6×105CFU/mL）菌液根据菌体浓度（CFU值）进行进行10n的倍比稀释，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，CPA-核酸试纸条法进行检测，检测的灵敏度达到了10-3即6×102CFU/mL，说明此方法具有较高的灵敏度。用普通PCR方法扩增不同稀释度的霍乱弧菌（ATCC14035）（6×105CFU/mL）?
【参考文献】：
期刊论文
[1]DNA环介导恒温扩增技术快速检测霍乱弧菌[J]. 徐义刚,李苏龙,李丹丹,张洪祥,姜艳春. 生物工程学报. 2010(03)
[2]不同群型霍乱弧菌recA、dnaE和mdh管家基因序列分析[J]. 芮勇宇,阚飙,高守一,刘延清,祁国明. 南方医科大学学报. 2006(12)
本文编号：3301491
【文章来源】：生物技术通报. 2013,(07)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
可行性验证试纸条结果图
lyticus（ATCC17802）-Vibrioparahaemolyticus（ATCC27519）-Vibrioalginolyticus（ATCC33787）-Vibrioalginolyticus（ATCC17749）-Escherichiacoli（ATCC25922）-Staphylococcusaureus（ATCC25923）-2.4灵敏度试验结果用霍乱弧菌CPA-核酸试纸条快速检测方法的最佳反应体系扩增不同稀释度的霍乱弧菌（ATCC14035）（6×105CFU/mL），从试纸条结果看，随着模板浓度的降低，至稀释度为10-4时，没有出现检测线，说明此方法的检测灵敏度为起始菌液浓度的10-3即6×102CFU/mL。从电泳结果（图3）可以看出，随着模板浓度的降低，至稀释度为10-4时没有扩增产物，与试纸条的结果一致。1：10-1；2：10-2；3：10-3；4：10-4；5：阴性对照；M：marker图3灵敏度试验试纸条结果（A）以及灵敏度试验电泳结果（B）2.5普通PCR方法与CPA方法的比较结果用普通PCR方法扩增不同稀释度的霍乱弧菌（ATCC14035）（6×105CFU/mL）的DNA提取液，经琼脂糖凝胶电泳检测会出现588bp的扩增产物（图4）。结果表明，普通PCR方法在稀释度为10-3时就没有扩增产物即检测灵敏度为6×103CFU/mL。由此可以看出，CPA反应的灵敏度是普通PCR的10倍。3讨论传统分离鉴定法检测霍乱弧菌至少需要十几个小时才能完成，耗时较长。最近几年发展起来的荧光定量PCR方法、普通PCR方法等分子生物学方法由于受到仪器和设备的限制，虽然效果较好，但很难在基层大范围推广使用。因此需要建立一种灵敏度高、特异性强、简便、快速、便于在基层大规模推广的霍乱弧菌的检测技术。
2013年第7期171秦强等：CPA-核酸试纸条快速检测霍乱弧菌方法的建立与优化CPA方法是一种新颖的恒温扩增方法，具有很高的特异性和灵敏度，而且它是在恒温下进行扩增反应，仪器设备简单，只需能够保持恒定的温度即可。本研究把CPA方法与核酸试纸条检测方法结合起来，不需要通过电泳，可直接用核酸试纸条检测扩增结果，简便、快速，对于霍乱疫情的的应急诊断和监测具有重要意义。霍乱弧菌的mdh管家基因在不同的群型中具有高度的保守性，是作为靶基因的理想选择。本实验以mdh为靶基因，经过精确的引物设计、探针设计和对反应体系及反应条件的优化，建立了霍乱弧菌CPA-核酸试纸条快速检测方法。引物和探针的特异性和反应浓度对该方法的特异性和灵敏度起着决定性的作用，本试验根据目的序列的5个不同的区域设计了两对引物和两条探针，通过改变反应温度、BstDNAPolymerase的量、Betaine浓度、MgSO4浓度、引物和探针浓度进行反应体系的优化，最终确立了20μL的CPA的最佳反应体系，反应温度为63℃，60min即可完成反应，通过核酸试纸条可以直接判定反应结果，试验过程快速、简便。使用本研究的霍乱弧菌CPA-核酸试纸条快速检测方法检测实验室保存的霍乱弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌的结果与已知的菌株信息一致，证明该方法具有良好的特异性。将已知浓度的霍乱弧菌（ATCC14035）（6×105CFU/mL）菌液根据菌体浓度（CFU值）进行进行10n的倍比稀释，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，CPA-核酸试纸条法进行检测，检测的灵敏度达到了10-3即6×102CFU/mL，说明此方法具有较高的灵敏度。用普通PCR方法扩增不同稀释度的霍乱弧菌（ATCC14035）（6×105CFU/mL）?
【参考文献】：
期刊论文
[1]DNA环介导恒温扩增技术快速检测霍乱弧菌[J]. 徐义刚,李苏龙,李丹丹,张洪祥,姜艳春. 生物工程学报. 2010(03)
[2]不同群型霍乱弧菌recA、dnaE和mdh管家基因序列分析[J]. 芮勇宇,阚飙,高守一,刘延清,祁国明. 南方医科大学学报. 2006(12)
本文编号：3301491
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