PKC抑制剂STAUROSPORINE对小鼠腔前卵泡体外发育影响的研究

发布时间：2021-07-24 21:15

　　哺乳动物卵泡发育是一个复杂的过程,主要包括卵母细胞的生长和减数分裂、颗粒细胞增殖、分化,涉及卵母细胞和颗粒细胞间的协同发育和调控等。蛋白激酶C（PKC）超家族包括多种成员,主要分为三类,经典型PKC、新型PKC和非典型PKC。PKC超家族成员在多种细胞类型的增殖和分化等过程中发挥着重要的调控作用。PKC信号通路在哺乳动物卵母细胞减数分裂恢复过程中发挥着重要的调节作用,卵丘细胞中PKC的活化可以促进卵母细胞恢复减数分裂,而卵母细胞中的PKC则抑制卵母细胞成熟,但是PKC在卵泡发育过程中的作用尚不明了。本课题利用小鼠腔前卵泡体外培养模型和PKC广谱抑制剂staurosporine（星形孢菌素）,研究在腔前卵泡体外培养过程中的不同阶段抑制PKC后其对卵泡发育、颗粒细胞增殖和细胞凋亡的影响,并通过检测抑制PKC后对卵泡颗粒细胞缝隙连接蛋白connexin（Cx）43的定位和表达、Smad家族成员Smad4的表达等,尝试揭示PKC参与卵泡发育和颗粒细胞功能的调控机制。主要研究结果如下：1.抑制PKC严重影响小鼠腔前卵泡的体外发育进程。我们从出生后12天雌性昆明小鼠卵巢内剥离出腔前卵泡进行体外培养... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：73 页

【学位级别】：硕士

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目录
摘要
ABSTRACT
缩略语表(Abbreviation)
1 前言
    1.1 PKC信号通路在细胞中作用的研究进展
        1.1.1 PKC信号通路与细胞增殖
        1.1.2 PKC信号通路与细胞凋亡
        1.1.3 PKC信号通路与细胞缝隙连接
        1.1.4 PKC信号通路与TGF-β/Smad家族
    1.2 哺乳动物卵泡发育机制的研究进展
        1.2.1 激素类
        1.2.2 TGF-β超家族
        1.2.3 细胞缝隙连接
        1.2.4 丝裂原活化蛋白激酶
    1.3 蛋白激酶C与哺乳动物卵泡发育的相互影响
        1.3.1 蛋白激酶C与颗粒细胞增殖
        1.3.2 蛋白激酶C与卵母细胞恢复减数分裂
2 研究目的及意义
3 实验材料与方法
    3.1 实验材料
        3.1.1 主要试剂与抗体
        3.1.2 主要仪器设备
        3.1.3 主要溶液及相关缓冲液
    3.2 实验方法
        3.2.1 腔前卵泡的剥离与培养
        3.2.2 颗粒细胞培养
        3.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡
        3.2.4 免疫荧光细胞化学(颗粒细胞)
        3.2.5 免疫荧光细胞化学(腔前卵泡)
        3.2.6 共聚焦显微镜采集图像
        3.2.7 蛋白提取
        3.2.8 蛋白浓度检测
        3.2.9 免疫印记
        3.2.10 实时荧光定量PCR(QPCR)
            3.2.10.1 试剂
            3.2.10.2 仪器
            3.2.10.3 具体步骤
        3.2.11 统计分析
4 实验结果
    4.1 Staurosporine影响腔前卵泡体外发育
        4.1.1 Staurosporine抑制腔前卵泡体外发育
        4.1.2 Staurosporine抑制成熟卵泡体外诱导排卵
    4.2 PKC抑制剂staurosporine诱导体外培养颗粒细胞凋亡
        4.2.1 不同浓度的staurosporine影响体外培养颗粒细胞形态结构
        4.2.2 staurosporine以浓度依赖方式诱导体外培养颗粒细胞发生凋亡
        4.2.3 staurosporine诱导凋亡相关基因表达
        4.2.4 其它种类PKC抑制剂对体外培养颗粒细胞凋亡及坏死的影响
    4.3 Staurosporine对腔前卵泡和颗粒细胞中缝隙连接蛋白connexin43表达和定位的影响
        4.3.1 Staurosporine影响腔前卵泡中缝隙连接蛋白connexin43的定位
        4.3.2 Staurosporine影响颗粒细胞中缝隙连接蛋白connexin43的定位
    4.4 Staurosporine对体外培养颗粒细胞smad4蛋白表达的影响
        4.4.1 Staurosporine影响腔前卵泡smad4蛋白表达
        4.4.2 Staurosporine对体外培养颗粒细胞smad4蛋白表达的影响
5 讨论
    5.1 阻断PKC信号通路可抑制腔前卵泡体外发育
    5.2 阻断PKC信号通路促进体外培养颗粒细胞发生凋亡
    5.3 PKC抑制剂staurosporine影响细胞缝隙连接蛋白connexin43及其磷酸化
    5.4 PKC抑制剂staurosporine影响Smad4蛋白
    5.5 小结
参考文献
附录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]间隙连接蛋白在卵泡发育过程中的作用[J]. 侯建华,岑尧,马玉珍.  现代生物医学进展. 2012(09)
[2]Connexin43磷酸化调节与细胞间隙连接通讯功能[J]. 王苏,张永兴.  中国公共卫生. 2012(03)
[3]细胞间隙连接蛋白26、32的研究现状[J]. 李纳,郭瑞珍.  中国医药指南. 2011(30)
[4]TGF-β/Smads信号转导通路的研究进展[J]. 张勇,秦娜,于斌.  广西医科大学学报. 2009(01)
[5]TGF-β/Smads信号转导通路的研究进展[J]. 朱翠,丁丽华,曾宪垠,叶棋浓.  生物技术通讯. 2008(04)
[6]原癌基因c-erbB2和c-myb经丝裂原活化蛋白激酶和成熟促进因子途径调节卵母细胞的成熟[J]. 郑月慧,郑莉萍,李芳,吴磊,戴育成.  生理学报. 2008(01)
[7]Smad4蛋白的研究进展[J]. 孙琰,叶棋浓.  生物技术通讯. 2005(03)
[8]Smad4蛋白及mRNA在卵巢不同发育阶段的表达[J]. 苗竹林,王自能,章韵,程龙球.  中国病理生理杂志. 2005(05)
[9]蛋白激酶C在卵母细胞减数分裂成熟和受精中的作用[J]. 范衡宇,佟超,陈大元,孙青原.  自然科学进展. 2003(05)
[10]Caspases与细胞凋亡[J]. 李嘉琦,吴娟.  动物医学进展. 2003(01)



本文编号：3301442