基于丝氨酸蛋白酶抑制因子WM5的猪旋毛虫检测方法的建立
发布时间：2021-07-26 18:48
旋毛虫病是由于人类摄入含有旋毛虫的肉类而感染的危害严重的人兽共患病,该病不仅对人和动物的身体健康产生巨大的伤害,同时对畜牧养殖和肉类进出口也造成了极大的经济损失。基于旋毛虫肌幼虫ES抗原建立的ELISA检测方法是世界动物卫生组织推荐使用的血清学检测方法,但ES抗原制备困难。因此,研究出一种制备工艺便捷、特异性和灵敏度高的旋毛虫病检测方法,对保障社会的公共卫生安全、维护肉类进出口贸易的稳定、减少畜牧业的损失有着重要意义。丝氨酸蛋白酶抑制因子（Serine proteinase inhibitor,Serpin）是一类结构相对保守的蛋白质超家族,它能抑制丝氨酸蛋白酶在凝血、补体激活和炎症中的功能,且在多种生物系统中发挥着重要的生理作用。目前,已有研究证实丝氨酸蛋白酶抑制因子在旋毛虫发育的各个阶段均有转录表达,但是以丝氨酸蛋白酶抑制因子WM5作为检测抗原,建立猪旋毛虫感染的诊断方法却没有系统的报道。首先,本实验室前期通过免疫学方法对旋毛虫肌幼虫时期的cDNA表达文库进行筛选时,发现了高丰度且具有强反应原性的丝氨酸蛋白酶抑制因子WM5抗原。本研究利用已构建好的WM5原核表达系统诱导表达WM5重...
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
WM5重组蛋白的表达与可溶性分析
第二篇研究内容第一章WM5重组蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备20solubilityanalysis.M:ProteinMarker;5:inclusionbody;6:supernatant1.3.1.2WM5重组蛋白的纯化用AKTApurifier100系统对洗涤后的包涵体进行纯化，并用不同浓度的咪唑进行洗脱，SDS-PAGE结果表明咪唑浓度为300mmol/L时洗脱的蛋白浓度较高，且洗脱较为完全（图1.2A）。回收得到的蛋白经SDS-PAGE鉴定，在37kDa处有单一条带（图1.2B），利用BCA法测定回收蛋白的浓度为2.8mg/mL。图1.2WM5重组蛋白的SDS-PAGE鉴定A：不同浓度的咪唑洗脱回收蛋白的SDS-PAGE结果M：蛋白分子量标准；1：WM5包涵体；2：30mmol/L咪唑洗脱回收蛋白；3：50mmol/L咪唑洗脱回收蛋白；4：100mmol/L咪唑洗脱回收蛋白；5：300mmol/L咪唑洗脱回收蛋白；6：500mmol/L咪唑洗脱回收蛋白B：纯化后WM5重组蛋白SDS-PAGEM：蛋白分子量标准；7：纯化后WM5重组蛋白Fig.1.2SDS-PAGEidentificationofrecombinantWM5proteinA:SDS-PAGEofproteincollectedatdifferentimidazoleconcentration.M:ProteinMarker;1:inclusionbody;2:proteinrecoveredat30mmol/Limidazole;3:proteinrecoveredat50mmol/Limidazole;4:proteinrecoveredat100mmol/Limidazole;5:proteinrecoveredat300mmol/Limidazole;6:proteinrecoveredat500mmol/LimidazoleB:SDS-PAGEofpenetrativeandpurifiedrecombinantWM5protein.M:ProteinMarker;7:recombinantWM5afterpurification1.3.2WM5重组蛋白抗原性分析将WM5重组蛋白与感染剂量为1000条/只的猪阳性血清进行反应，Westernblot结果如图1.3所示，猪旋毛虫感染的阳性血清可以特异性地识别WM5重组蛋白，表明WM5重组蛋白具有较强的免疫反应性，进而可作为检测猪旋毛虫感染的候选抗原。图1.3WM5重组蛋白的W
dat50mmol/Limidazole;4:proteinrecoveredat100mmol/Limidazole;5:proteinrecoveredat300mmol/Limidazole;6:proteinrecoveredat500mmol/LimidazoleB:SDS-PAGEofpenetrativeandpurifiedrecombinantWM5protein.M:ProteinMarker;7:recombinantWM5afterpurification1.3.2WM5重组蛋白抗原性分析将WM5重组蛋白与感染剂量为1000条/只的猪阳性血清进行反应，Westernblot结果如图1.3所示，猪旋毛虫感染的阳性血清可以特异性地识别WM5重组蛋白，表明WM5重组蛋白具有较强的免疫反应性，进而可作为检测猪旋毛虫感染的候选抗原。图1.3WM5重组蛋白的Westernblot分析
【参考文献】：
期刊论文
[1]旋毛虫Ts-Sp-7蛋白的表达纯化及其多克隆抗体的制备[J]. 张胜兰,刘琰,李岩松,刘晓雷,白雪,唐斌,王学林,刘明远,周玉. 中国兽医科学. 2019(11)
[2]上转发光免疫层析技术快速检测猪抗旋毛虫IgG抗体方法的建立[J]. 王春,张平平,赵勇,唐斌,刘晓雷,白雪,李仕存,刘明远,王学林. 中国兽医学报. 2019(05)
[3]旋毛虫TsGLS和TsGAD重组蛋白免疫保护作用的研究[J]. 孟诗,张妍,李晓云,于洁,王爽,李成,刘宇琦,陈博,孟小晴,宋铭忻. 中国兽医科学. 2019(04)
[4]运动对废用性骨质疏松大鼠破骨细胞分化JNK/AP-1信号通路的影响[J]. 马涛,贾磊,苏红燕. 西安体育学院学报. 2017(05)
[5]一株具有良好粘附性的植物乳杆菌的生物学特性及应用[J]. 刘英男,王光强,夏永军,张汇,熊智强,艾连中. 工业微生物. 2017(02)
[6]旋毛虫LAMP检测方法的建立与应用[J]. 黄芸,徐立新,宋小凯,李祥瑞,严若峰. 中国兽医科学. 2017(04)
[7]旋毛虫成虫DNaseⅡ—T3223-7基因的克隆及其表达特性鉴定[J]. 王安琪,丁静,王楠,王兆国,胡晓祥,吴秀萍,刘明远,廖成水. 中国兽医学报. 2017(01)
[8]旋毛虫成虫排泄分泌蛋白组分分析[J]. 杨小迪,陶志勇,程洋,吴琦,王小莉,宋迪,徐岚松,薛仁敏,常雪莲,张慧,汪瑞,陈兴智,方强. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2017(01)
[9]旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达及免疫相关性[J]. 马静,李达,孔令杰,刘畅,李爽,毛贻贤,杜娟,路义鑫. 中国兽医学报. 2015(08)
[10]旋毛虫成虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的原核表达及免疫原性研究[J]. 李达,万悦,马静,孔令杰,路佳琦,武文浩,路义鑫. 中国兽医杂志. 2015(03)
博士论文
[1]旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达及活性分析[D]. 张朝霞.东北农业大学 2016
[2]环介导等温扩增（LAMP）技术检测旋毛虫DNA的研究[D]. 李雪莲.郑州大学 2016
[3]旋毛虫不同发育时期抗原基因的筛选与鉴定[D]. 吴秀萍.吉林大学 2009
[4]高质量基因重组蛋白在屠宰动物旋毛虫病诊断中的应用[D]. 于申业.吉林大学 2009
硕士论文
[1]旋毛虫病荧光免疫层析抗体检测试纸条的建立[D]. 张小波.吉林大学 2018
[2]旋毛虫病ELISA和PCR诊断方法的建立[D]. 路丽群.东北农业大学 2018
[3]旋毛虫排泄分泌物抗原在鼠和猪免疫学诊断中的应用研究[D]. 孙召金.吉林大学 2015
[4]旋毛虫P53ES基因重组蛋白单克隆抗体的制备和鉴定[D]. 雷帅.东北农业大学 2009
本文编号：3304145
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
WM5重组蛋白的表达与可溶性分析
第二篇研究内容第一章WM5重组蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备20solubilityanalysis.M:ProteinMarker;5:inclusionbody;6:supernatant1.3.1.2WM5重组蛋白的纯化用AKTApurifier100系统对洗涤后的包涵体进行纯化，并用不同浓度的咪唑进行洗脱，SDS-PAGE结果表明咪唑浓度为300mmol/L时洗脱的蛋白浓度较高，且洗脱较为完全（图1.2A）。回收得到的蛋白经SDS-PAGE鉴定，在37kDa处有单一条带（图1.2B），利用BCA法测定回收蛋白的浓度为2.8mg/mL。图1.2WM5重组蛋白的SDS-PAGE鉴定A：不同浓度的咪唑洗脱回收蛋白的SDS-PAGE结果M：蛋白分子量标准；1：WM5包涵体；2：30mmol/L咪唑洗脱回收蛋白；3：50mmol/L咪唑洗脱回收蛋白；4：100mmol/L咪唑洗脱回收蛋白；5：300mmol/L咪唑洗脱回收蛋白；6：500mmol/L咪唑洗脱回收蛋白B：纯化后WM5重组蛋白SDS-PAGEM：蛋白分子量标准；7：纯化后WM5重组蛋白Fig.1.2SDS-PAGEidentificationofrecombinantWM5proteinA:SDS-PAGEofproteincollectedatdifferentimidazoleconcentration.M:ProteinMarker;1:inclusionbody;2:proteinrecoveredat30mmol/Limidazole;3:proteinrecoveredat50mmol/Limidazole;4:proteinrecoveredat100mmol/Limidazole;5:proteinrecoveredat300mmol/Limidazole;6:proteinrecoveredat500mmol/LimidazoleB:SDS-PAGEofpenetrativeandpurifiedrecombinantWM5protein.M:ProteinMarker;7:recombinantWM5afterpurification1.3.2WM5重组蛋白抗原性分析将WM5重组蛋白与感染剂量为1000条/只的猪阳性血清进行反应，Westernblot结果如图1.3所示，猪旋毛虫感染的阳性血清可以特异性地识别WM5重组蛋白，表明WM5重组蛋白具有较强的免疫反应性，进而可作为检测猪旋毛虫感染的候选抗原。图1.3WM5重组蛋白的W
dat50mmol/Limidazole;4:proteinrecoveredat100mmol/Limidazole;5:proteinrecoveredat300mmol/Limidazole;6:proteinrecoveredat500mmol/LimidazoleB:SDS-PAGEofpenetrativeandpurifiedrecombinantWM5protein.M:ProteinMarker;7:recombinantWM5afterpurification1.3.2WM5重组蛋白抗原性分析将WM5重组蛋白与感染剂量为1000条/只的猪阳性血清进行反应，Westernblot结果如图1.3所示，猪旋毛虫感染的阳性血清可以特异性地识别WM5重组蛋白，表明WM5重组蛋白具有较强的免疫反应性，进而可作为检测猪旋毛虫感染的候选抗原。图1.3WM5重组蛋白的Westernblot分析
【参考文献】：
期刊论文
[1]旋毛虫Ts-Sp-7蛋白的表达纯化及其多克隆抗体的制备[J]. 张胜兰,刘琰,李岩松,刘晓雷,白雪,唐斌,王学林,刘明远,周玉. 中国兽医科学. 2019(11)
[2]上转发光免疫层析技术快速检测猪抗旋毛虫IgG抗体方法的建立[J]. 王春,张平平,赵勇,唐斌,刘晓雷,白雪,李仕存,刘明远,王学林. 中国兽医学报. 2019(05)
[3]旋毛虫TsGLS和TsGAD重组蛋白免疫保护作用的研究[J]. 孟诗,张妍,李晓云,于洁,王爽,李成,刘宇琦,陈博,孟小晴,宋铭忻. 中国兽医科学. 2019(04)
[4]运动对废用性骨质疏松大鼠破骨细胞分化JNK/AP-1信号通路的影响[J]. 马涛,贾磊,苏红燕. 西安体育学院学报. 2017(05)
[5]一株具有良好粘附性的植物乳杆菌的生物学特性及应用[J]. 刘英男,王光强,夏永军,张汇,熊智强,艾连中. 工业微生物. 2017(02)
[6]旋毛虫LAMP检测方法的建立与应用[J]. 黄芸,徐立新,宋小凯,李祥瑞,严若峰. 中国兽医科学. 2017(04)
[7]旋毛虫成虫DNaseⅡ—T3223-7基因的克隆及其表达特性鉴定[J]. 王安琪,丁静,王楠,王兆国,胡晓祥,吴秀萍,刘明远,廖成水. 中国兽医学报. 2017(01)
[8]旋毛虫成虫排泄分泌蛋白组分分析[J]. 杨小迪,陶志勇,程洋,吴琦,王小莉,宋迪,徐岚松,薛仁敏,常雪莲,张慧,汪瑞,陈兴智,方强. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2017(01)
[9]旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达及免疫相关性[J]. 马静,李达,孔令杰,刘畅,李爽,毛贻贤,杜娟,路义鑫. 中国兽医学报. 2015(08)
[10]旋毛虫成虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的原核表达及免疫原性研究[J]. 李达,万悦,马静,孔令杰,路佳琦,武文浩,路义鑫. 中国兽医杂志. 2015(03)
博士论文
[1]旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达及活性分析[D]. 张朝霞.东北农业大学 2016
[2]环介导等温扩增（LAMP）技术检测旋毛虫DNA的研究[D]. 李雪莲.郑州大学 2016
[3]旋毛虫不同发育时期抗原基因的筛选与鉴定[D]. 吴秀萍.吉林大学 2009
[4]高质量基因重组蛋白在屠宰动物旋毛虫病诊断中的应用[D]. 于申业.吉林大学 2009
硕士论文
[1]旋毛虫病荧光免疫层析抗体检测试纸条的建立[D]. 张小波.吉林大学 2018
[2]旋毛虫病ELISA和PCR诊断方法的建立[D]. 路丽群.东北农业大学 2018
[3]旋毛虫排泄分泌物抗原在鼠和猪免疫学诊断中的应用研究[D]. 孙召金.吉林大学 2015
[4]旋毛虫P53ES基因重组蛋白单克隆抗体的制备和鉴定[D]. 雷帅.东北农业大学 2009
本文编号：3304145
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